猪瘟病毒实时荧光定量PCR检测方法的建立及初步应用

杨 峰，陈立强 ，许信刚，张为民*，张 琪*

(1.西北农林科技大学动物医学院，陕西杨凌 712100；2.安康学院现代农业与生物科技学院，陕西安康 725000)

猪瘟病毒(Classical swine fever virus，CSFV)属于黄病毒科瘟病毒属，感染猪机体后会导致猪瘟，造成严重的经济损失，世界动物卫生组织(OIE)将猪瘟列为必须报告的动物传染病之一，我国将其列为一类动物疫病[1]。CSFV感染猪不分年龄、性别和品种，四季均可发生，哺乳仔猪和保育仔猪发病率较高，成年猪长期带毒、排毒，形成垂直和水平传播，在猪场反复循环。我国除西藏等地外，其他地区时有CSF发生的报道，给我国养猪业造成了严重的经济损失[2-3]。

自20世纪90年代以来，随着我国对猪瘟疫苗的大面积使用，猪瘟常呈非典型的温和临床经过，以及长期的隐性带毒感染，这给临床诊断造成了较大的困难[4]。因此，临床上常借助反转录PCR(reverse transcription PCR，RT-PCR)方法检测CSFV，然而,常规的RT-PCR方法在灵敏度和重复性以及病毒含量测定等方面存在一些不足。实时荧光定量PCR(real-time fluorescence quantitative PCR，RT-qPCR)因具有操作简单、灵敏度高、重复性好、耗时短、结果量化等优点，逐渐在实验室对CSFV检测中得到了广泛的应用[5-8]，其中SYBR Green荧光染料法RT-qPCR比探针法费用较低，故得到较普遍的使用，但其存在染料重分布等缺点，而饱和荧光染料Eva Green解决了这一问题。本研究针对NCBI中登录的猪瘟病毒的E2基因设计特异性引物，建立基于Eva Green荧光染料的 RT-qPCR检测方法，以期为CSFV的临床检测提供一种特异、灵敏、快速及量化的方法，能够高效、快速地的检出早期感染和隐性带毒者，为猪瘟防控与净化提供技术支撑。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 毒株和菌株 猪瘟病毒(CSFV)、猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)、猪圆环病毒2型(Porcine circovirus 2，PCV2)和猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)，西北农林科技大学动物医学院微生物实验室分离保存；感受态细胞DH5α大肠埃希氏菌，购自康维世纪生物科技公司。

1.1.2 待检组织或病料 31份病料来自陕西省不同地区规模化养猪场临床剖检疑似感染CSFV猪的扁桃体、淋巴结和脾脏等，每头猪的各种组织混合为1份病料。

1.1.3 主要试剂 DNA Marker DL2 000和2×TaqMaster Mix，康维世纪生物科技公司产品；Trizol试剂、RNA逆转录试剂盒，天根生化科技公司产品；EasyPure Quick Gel Extraction Kit、pEAST-T1克隆试剂盒、质粒提取试剂盒，全式金生物公司产品；2×Eva Green Premix，ABM生物科技公司产品。

1.1.4 主要仪器 实时荧光定量PCR仪(TL988)，西安天隆生物仪器有限公司;高速冷冻离心机(D3024R)，美国贝克曼股份有限公司产品；立式压力蒸汽灭菌器(LS-50HJ)，江阴滨江医疗设备有限公司产品；凝胶成像分析系统(Geno Sens1800)，北京赛智创业科技有限公司产品；电子天平(DTC)，亚津电子科技公司产品。

1.2 方法

1.2.1 引物设计及合成 参考NCBI中登录的猪瘟病毒的E2基因序列(EF683623.1，FJ598612.1，DQ907718.1等)，分析其保守序列，用Primer 5软件设计一对引物。所设计的荧光定量特异性上、下游引物序列分别为CSFV-F：5'- TTTACCCACTTCCGTGACATT -3'，CSFV-R：5'- GACACCCGTCCACCCTATT -3'，扩增片段长度为190 bp。引物由西安擎科泽西生物公司合成并稀释至10 μmol/L，4℃保存备用。

1.2.2 CSFV RNA的提取及逆转录 取保存的病毒液200 μL，加1 mL Trizol试剂，使用Trizol法提RNA，根据逆转录试剂盒说明书进行逆转录，得到的cDNA置 -20℃存储或进行普通RT-PCR。

1.2.3 RT-PCR扩增 反应体系50 μL：2×TaqMaster Mix、模板、上游引物、下游引物分别为25 μL、6 μL、4 μL、4 μL，双蒸水补足。反应条件：95 ℃ 5 min；95 ℃ 25 s，56 ℃ 20 s，72 ℃ 20 s，共30个循环；72℃ 10 min。

1.2.4 RT-qPCR阳性质粒及标准模板制备 按照胶回收试剂盒回收1.2.3扩增的目的片段，并将其按照pEAST-T1克隆试剂盒构建重组质粒菌。重组质粒菌经常规PCR鉴定为阳性后，将重组质粒菌中的阳性质粒按照试剂盒的操作步骤提取，进行测序分析。用超微量光谱分析仪测定阳性质粒浓度，按照以下公式将浓度转化为拷贝数，然后进行10-1～10-9的梯度稀释。稀释后的质粒作为标准模板，置-20 ℃保存备用。拷贝数(copies/μL)=C×NA/MW，式中C为阳性质粒测定的浓度，单位为ng/μL，NA取值为6.02×1023copies/mol，MW为平均分子量，单位为Dolton。

1.2.5 RT-qPCR扩增 反应体系10 μL：2×Eva Green Premix、标准模板、上游引物、下游引物分别为5 μL、1 μL、0.3 μL、0.3 μL，ddH2O补足。反应条件：95 ℃ 10 min：95 ℃ 3 s，60 ℃ 30 s，采集荧光信号，35个循环。

1.2.6 RT-qPCR反应标准曲线建立 选取浓度稀释了10-2～10-8的标准模板为模板，以双蒸水为阴性对照模板，进行RT-qPCR扩增。结果以RT-qPCR仪自带软件分析绘制扩增曲线、标准曲线和熔解曲线。

1.2.7 RT-qPCR特异性试验 用建立的RT-qPCR方法分别检测PEDV、PCV2、PRV、PRRSV的cDNA或者DNA，验证建立的RT-qPCR方法的特异性。

1.2.8 RT-qPCR灵敏性试验 选取浓度稀释了10-7～10-10的标准模板为阳性模板，以双蒸水为阴性对照模板，进行RT-qPCR方法。选取浓度稀释了10-6～10-9的标准模板为阳性模板，以双蒸水为阴性对照模板，进行常规PCR扩增，将所得结果进行对比，比较两种方法的灵敏度。

1.2.9 RT-qPCR重复性试验 以同一批次不同浓度的标准模板和不同批次不同浓度的标准模板为阳性模板，以双蒸水为阴性对照模板，进行RT-qPCR扩增，分别计算组内和组间变异系数。

1.2.10 临床样本的检测 取疑似CSFV感染的病料，加适量PBS研磨，将研磨液冻融3次后提取RNA并反转录，得到的cDNA做待测样本，以标准模板做阳性对照模板，以ddH2O为阴性对照模板，用所建立的RT-qPCR检测，然后将RT-qPCR检测为阳性的样品进行常规RT-PCR检测，统计结果进行比较。

2 结果

2.1 常规RT-PCR对猪瘟病毒E2基因的扩增

对CSFV E2基因进行常规RT-PCR扩增，结果与预期大小一致，目的片段为190 bp，而且无杂带(图1)，说明提取并逆转录得到的为CSFV的cDNA，且设计的引物可作为检测CSFV的特异性引物，可以进行后续试验。

M.DNA 标准DL 2 000;1.CSFV RT-PCR产物；2.阴性对照

2.2 重组阳性质粒常规PCR鉴定

将菌液用荧光定量特异性引物进行常规PCR检测，结果为190 bp目的片段(图2)。将鉴定为阳性的质粒测序，通过Blast比对，结果同源性达99%，说明重组质粒构建成功。

M.DNA 标准DL 2 000;1.阳性质粒普通PCR产物；2.阴性对照M.DNA Marker DL 2 000;1.PCR products of positive plasmids;2.Negative control

2.3 RT-qPCR标准模板的制备

用超微量光谱分析仪测定提取质粒的浓度为110.5 ng/μL，OD260/OD280值为1.885，计算得拷贝数为2.447×1010copies/μL，将其稀释至浓度分别为2.447×109、2.447×108、2.447×107、2.447×106、2.447×105、2.447×104、2.447×103、2.447×102、2.447×101、2.447×100copies/μL，置-20℃保存备用。

2.4 RT-qPCR反应标准曲线建立

RT-qPCR 标准模板的扩增曲线如图3所示，相应的标准曲线如图4所示，其熔解曲线如图5所示。在2.447×102copies/μL～2.447×108copies/μL的浓度区间内，所得拷贝数(x)与Ct值(y)的线性方程为y=-3.285+36.158x，线性相关系数R2=1.000，显示了良好的线性关系。熔解曲线峰型单一，无杂峰，熔解温度一致， Tm=83.5 ℃。

1～7.2.447×108 copies/μL～2.447×102 copies/μL；NC.阴性对照1-7.RT-qPCR amplification curve of 2.447×108 copies/μL to 2.447×102 copies/μL；NC.Negative control

图4 实时荧光定量PCR标准曲线

图5 实时荧光定量PCR熔解曲线

2.5 RT-qPCR特异性试验

分别以PEDV、PCV2、PRV和PRRSV的cDNA或者DNA为反应模板，用建立的RT-qPCR方法扩增，结果表明只有CSFV有荧光信号(图6)，熔解曲线峰型单一，无杂峰，熔解温度为83.5 ℃(图7)，说明所建立的RT-qPCR特异性好。

图6 RT-qPCR特异性试验扩增曲线

图7 RT-qPCR特异性试验熔解曲线

2.6 RT-qPCR灵敏性试验

以2.447×103copies/μL～2.447×100copies/μL的标准模板为反应模板，进行RT-qPCR方法扩增。以 2.447×104copies/μL～2.447×101copies/μL的标准模板作为反应模板，进行普通PCR扩增。结果表明，RT-qPCR检测的拷贝数最低为2.447×101copies/μL(图8)，普通PCR检测的拷贝数最低为2.447×103copies/μL(图9)，说明建立的RT-qPCR检测方法比普通RT-PCR灵敏性提高100倍。

1～4.2.447×103 copies/μL～2.447×100 copies/μL;NC.阴性对照1-4.RT-qPCR amplification curve of 2.447×103 copies/μL to 2.447×100 copies/μL;NC. Negative control

M.DNA 标准DL 2 000;1～4. 2.447×104 copies/μL～2.447×101 copies/μL；NC.阴性对照M.DNA Marker DL 2 000;1-4.2.447×104 copies/μL to 2.447×101 copies/μL;NC.Negative control

2.7 RT-qPCR重复性试验

以2.447×106、2.447×106、2.447×104copies/μL的标准模板为反应模板，每个模板做3个重复，进行组内重复试验(表1)，每隔1周做1次，每次做3个重复，计算平均值，做3次，进行组间重复试验(表2)。结果显示，建立的RT-qPCR的变异系数小于1.5%，其重复性表现优异。

表1 RT-qPCR组内重复试验

表2 RT-qPCR组间重复试验

2.8 检测方法的初步应用

用普通RT-PCR和建立的RT-qPCR对怀疑CSFV感染的31份临床病料进行检测。结果用普通RT-PCR检出25份阳性，RT-qPCR检测出29份阳性(包括普通RT-PCR检出25份阳性在内)，RT-qPCR比普通RT-PCR多检出4份。

3 讨论

目前，我国猪瘟由大规模暴发转变为散发或地方流行，临床上由典型症状转变为非典型症状、隐性带毒、持续感染。因此，通过分子生物学技术检测手段对早期感染和隐性带毒者高效、快速的检出，就可以为猪瘟防控与净化提供一定的帮助。分子生物学检测方法主要有常规RT-PCR、套式RT-PCR、多重RT-PCR及实时荧光定量RT-PCR,其中用荧光标记方法检测特异性产物的RT-qPCR技术，因其灵敏度高、重复性好、定量准确、耗时短、过程封闭等众多优点，逐渐在病原体检测、目的基因表达量、疫苗质量控制等方面得到广泛的使用[9]。

RT-qPCR有荧光染料法和Taqman探针法两种，由于Taqman探针法相对荧光染料法比较昂贵，因此使用最多的是荧光染料法，其中SYBR荧光法使用的最普遍，然而该荧光是一种不饱和荧光，在浓度高的时候会对PCR的扩增过程产生一定的抑制，所以在使用时加入的量相对较小，这样又会致使DNA的双链位点不能被荧光染料充分的全部结合。但是Eva Green与此不同，它是饱和荧光染料，没有非饱和染料“染料重排”的缺点，制作的熔解曲线分辨率相对较高，而且其可以在扩增过程当中及时地从DNA双链中释放出来，从而降低了对PCR扩增过程的影响，因此使用Eva Green染料定量，比使用SYBR染料准确性高[10]。故此，本研究选取Eva Green作为RT-qPCR的荧光染料。

因为荧光染料能够被结合到任何脱氧核糖核酸的双链间，所以RT-qPCR荧光染料法的引物在设计时要认真考虑长度、退火温度、保守性、二聚体、发夹结构等方面的问题，尤其是其中的引物二聚体和发夹结构问题，其关系到定量的准确性[11]。在试验时，还要注意做好防污染工作，尽管试验操作比较简单，但操作中的污染如气溶胶的污染会出现假阳性的结果；在制作标准模板时，要使阳性质粒完全混合均匀，以此保证标准模板的浓度梯度正确性。以上方面考虑的越周全，得到的结果越稳定，越可靠。

国内流行的猪瘟病毒基因型以基因2群和1群为主[12]，其中CSFV E2基因的蛋白对病毒毒力影响很大[13]，因此本研究选择CSFV E2基因的保守序列，设计了一对用于RT-qPCR扩增目的片段为190 bp的特异性引物，构建阳性质粒标准模板，将Eva Green作为信号报告荧光。结果表明，建立的CSFV RT-qPCR检测方法的标准曲线线性关系良好，各梯度标准模板扩增效率一致，熔解曲线峰型单一。本研究建立的CSFV RT-qPCR检测方法特异性强，只能检测出CSFV，最低检测拷贝数为2.447×101copies/μL，与普通RT-PCR相比灵敏性提高100倍；重复试验的变异系数在1.5%之内，重复性良好；用建立的RT-qPCR方法检测31份怀疑CSFV感染的样本，结果比普通RT-PCR的检测结果多出4份阳性；整个RT-qPCR扩增过程只需45 min，时间过程短。综上所述，本研究建立的猪瘟病毒实时荧光定量PCR检测方法具有良好的特异性、灵敏性和重复性，而且耗时短，可用于临床检测猪瘟病毒感染。