长链非编码RNA H19在生殖系统中的研究进展

孙大林，金保方，蔡滨，邓伟民

(东南大学附属中大医院，南京 210009)

长链非编码RNA(lncRNA)是一类转录本长度大于200个核苷酸的RNA，因其缺乏开放性阅读框而不具备编码蛋白质功能，但能以RNA 的形式通过多种方式调控基因的表达，进而参与多种生理活动。H19是人类最早发现的lncRNA分子，位于人类染色体11p15.5，全长2.3 kb，包括5个外显子及4个内含子，是首个被发现具有基因印迹功能的lncRNA[1]。H19在胚胎发育期主要集中表达于内胚层及中胚层来源的组织，出生后主要在心肌、骨骼肌、乳腺、子宫、卵巢和睾丸中表达。既往关于H19的研究多集中在生长发育、糖代谢和肿瘤转移等方面，近期越来越多的研究表明H19在生殖系统多种疾病中发挥重要作用。本文就H19在生殖道肿瘤、性激素合成、生精功能、复发性流产(RSA)和辅助生殖技术(ART)中的作用作一综述。

一、H19与生殖道肿瘤

H19的异常表达与肿瘤的发生密切有关，并且与肿瘤的复发、转移及患者的预后生存等相关。近期研究证实，H19与生殖道肿瘤有着不同程度的相关性。

1.卵巢癌(Ovarian cancer，OC)：OC是死亡率最高的生殖道恶性肿瘤，Mizrahi等[2]对OC患者的腹水细胞进行原位杂交检测发现，90%患者的腹水细胞中可检测到H19 RNA。Zhu等[3]使用实时荧光定量聚合酶链反应(RT-PCR)技术检测发现，OC组织中H19的表达量是正常卵巢组织的2倍以上，4种OC细胞系中H19的表达量较正常卵巢细胞系均明显升高，尤其是SKOV3细胞中H19的表达量是正常卵巢细胞的5倍之多。抑制OC模型鼠局部H19表达，肿瘤生长可降低40%[3]。Medrzycki等[4]过表达OC细胞系中组蛋白变体H1.3，降低H19表达，造成细胞增殖及生长速率均显著低于对照组；而降低H1.3表达，增加H19基因的表达后，细胞的增殖及生长速率显著增高。Yan等[5]研究还证实，过表达OC细胞系H19基因，细胞的侵袭力及迁移力均明显升高；降低H19基因表达，细胞侵袭力及迁移力均较空载体组明显下降。这都提示H19可能与OC的发生、发展、侵袭、转移有关。

2.子宫内膜癌(Endometrial cancer，EC)：EC发病率居女性肿瘤第4位，全世界每年有18.9万新增病例，约有4.5万例患者死亡[6]。Lottin等[7]采用原位杂交技术检测发现，EC组织中H19的表达明显高于正常子宫内膜组织。Tanos等[8]发现H19在正常子宫内膜上皮中的表达水平较低，但在增生性子宫内膜和EC组织中水平较高，并且随着肿瘤组织的持续去分化会进一步增加，提示H19可能参与EC的发病和进展。Zhang等[9]使用RT-PCR检测4种EC细胞系，发现H19可能是通过靶向miR-612调节靶基因HOXA10的表达水平，促进细胞增殖，从而影响EC的发展。Zhu等[10]发现H19还可通过miR-20b-5p/AXL/HIF-1a信号通路促进EC的形成，从而为EC的诊治提供了新靶点。Zhao等[11]通过RT-PCR检测，发现H19通过调节上皮细胞间质转型(EMT)过程，促进EC的侵袭性。Peng等[12]在TCGA数据集中研究了H19在子宫内膜癌中的预后价值，表明H19表达较高患者的总生存期明显低于H19表达较低的患者。说明H19对EC的转移和预后均有一定的作用价值。

3.宫颈癌(cervical cancer，CC)：CC是全世界妇女的主要死因之一，每年约有53万新增病例和27.5万死亡病例，且发病率有上升趋势[13]。人乳头状瘤病毒(HPV)感染是CC发病的最主要因素。Vidal等[14]通过检测148例正常对照和38例宫颈上皮内瘤变(CIN)、48例CC患者的宫颈活检标本，发现CIN和CC组的H19甲基化水平较低，处于高表达状态，会提高HPV易感性，增加浸润性CC和CIN的发生风险。Iempridee[15]研究发现，CC细胞系HeLa、MS751、SiHa和C33A中H19的表达均显著高于人原代成纤维细胞，并通过体外过度表达和敲除实验，证明H19可促进CC细胞增殖和肿瘤形成，但对细胞凋亡和迁移无明显影响。Ou等[16]通过体外细胞研究证实，H19可以通过结合miR-138-5p作用于靶基因SIRT1，进而调控CC细胞的增殖和凋亡，影响肿瘤进展。Roychowdhury等[17]通过临床病理分析发现，印度CC患者中H19基因缺失或启动子甲基化，导致基因的低表达，多预后不良。而Huang等[18]的研究表明，虽然H19中TT基因型rs2839698和rs3741219中GG基因型与CC的一些不良临床病理参数有关，但只有盆腔淋巴结状态才能显著预测患者5年生存率，并认为 H19单核苷酸与中国台湾妇女CC没有明显关联。

4.前列腺癌(Prostate cancer，Pca)：Pca是中老年男性最常见的恶性肿瘤之一，在美国居男性癌症致死的第3位[19]。我国Pca的发病率由1990年的4/100 000增长至2017年的20/100 000[20]。孙士成等[21]通过RT-PCR检测发现，H19在Pca组织中的表达水平较前列腺增生组织显著增高，且低分化癌中的表达水平明显高于高、中分化癌。在Pca细胞系中转染H19 siRNA后，细胞生长和糖代谢能力均显著下降。Zhu等[22]发现H19以及其产物miR-675在转移性PcaM12细胞系中的表达显著低于无转移性Pca上皮细胞系P69；过表达H19后，Pca细胞系P69和PC3 的细胞转移能力受到显著抑制；双荧光素酶报告实验显示miR-675可以与转化生长因子β1(TGF-β1)mRNA3′端结合，并且能抑制其翻译和促细胞粘附、运动功能。这说明H19可以通过miR-675调控靶基因TGF-β1的表达，从而抑制Pca的转移。这提示H19可作为诊断和治疗晚期Pca的潜在靶标。Bacci等[23]通过研究发现，H19在不同的Pca微环境中发挥不同的作用，在缺氧或单独雌激素条件下，H19水平增加，并通过减少钙黏蛋白(CDH1)，诱导上皮间质转化，显示致癌特性，促进Pca的转移；相反，在缺氧和雌激素联合刺激下，H19水平转录水平降低，CDH1和β整合素表达释放，将肿瘤传播转向内聚表型，具有抑制肿瘤转移作用。

二、H19与性激素合成

男性的主要生殖器官是睾丸，95%的睾酮(T)是在睾丸间质(Leydig)细胞内合成的。女性的主要生殖器官是卵巢，产生卵母细胞和分泌雌激素、孕激素。H19在出生后可在卵巢和睾丸中表达，对激素合成具有调节作用。

类固醇快速调节蛋白(StAR)调控胆固醇由线粒体外膜向线粒体内膜的转运，是多种性激素生物合成的步骤限速。Men等[24]通过在人KGN、HEK293和小鼠MLTC-1细胞系行H19过表达实验，发现H19可以结合miRNA Let-7，促进靶基因StAR的表达。随后Chen等[25]通过在KGN细胞系中过表达H19后，发现细胞合成孕酮的浓度显著增高。体外培养H19 KO雌鼠的卵巢颗粒细胞，发现其StAR的表达和孕酮的合成均显著低于野生型雌鼠。这说明H19可以通过结合Let-7，促进StAR合成，来调控性激素的合成功能。

抗苗勒管激素(AMH)主要由次级卵泡、窦前和窦状卵泡颗粒细胞表达，可调节卵泡的生长发育，能准确评估卵巢储备功能。AMH还可抑制卵泡的募集、选择，对生殖内分泌疾病如多囊卵巢综合征(PCOS)和卵巢储备功能下降(DOR)的发病机制及诊断有重要价值。Xia等[26]通过检测DOR患者(AMH<1.1 ng/ml，窦卵泡数<5枚)的血清和卵丘细胞H19表达情况，发现其血清H19表达水平显著低于卵巢功能正常组人群，且血清H19与血清AMH呈中度正相关，体外受精患者卵丘细胞中H19的表达比促性腺激素低应答者高3.7倍。因此认为血清和卵丘细胞中H19的下调与卵巢储备减少密切相关，并能通过AMH水平和取卵时的卵母细胞数量来衡量H19的表达。Qin等[27]通过动物和细胞实验发现，H19基因敲除小鼠生育能力下降，卵巢内AMH mRNA和蛋白表达水平均降低，卵泡募集加速，次级卵泡、窦前卵泡和窦性卵泡的自动发育增加；并且在促排卵时，E2明显增高，卵母细胞增多。表明H19具有抑制卵泡成熟，促进E2合成和促排卵的功能。提示H19/Let-7轴可以调控AMH的部分功能，是建立和维持卵泡池的重要调节因子。

三、H19与生精功能

精原干细胞(SSCs)是睾丸生精发生的起始细胞，是一群位于生精上皮基底部，具有高度自我更新和多向分化潜能的细胞。Bao等[28]使用基因芯片对lncRNAs在雄性生殖系统重新编程和出生后发育过程中的表达进行分析，发现包括H19在内大量的lncRNAs在生精过程中发挥功能，并且特定的lncRNAs可能调控着关键的发育阶段。

精子发生过程中，以基因组印记、DNA甲基化、组蛋白改变和染色体重组为特点的表观遗传学改变对精子的发生有着重要的调节作用。人胰岛素样生长因子2(IGF2)基因和H19基因为研究较早的一对相互毗邻的印迹基因，在生精过程中的调节作用，较早就得到研究。Santi等[29]荟萃分析了18项临床研究，共纳入879例男性不育患者和562例正常生育能力男性，发现不育患者的精液中H19甲基化平均水平显著低于正常对照，提示H19可能在生精过程中发挥重要作用。Song等[30]通过建立宫内环境内分泌干扰物2，2-二 (4-氯苯基) -1，1-二氯乙烯(p，p’-DDE)暴露跨代大鼠模型，观察p，p’-DDE对雄性子代的生殖毒性，发现F1～F3代雄性仔鼠数量和活力下降，精子细胞Igf2基因印迹控制区(DMR2)区域低甲基化，Igf2转录下调，H19转录上调，认为p，p’-DDE诱导的跨代雄性大鼠生殖毒性是通过Igf2/H19甲基化改变发挥作用的。Zhang等[31]通过实验把雄性小鼠暴露于苯并芘(BaP)，发现BaP暴露改变了父系精子H19、Meg3的甲基化水平，提示印记基因易受环境毒物的影响。此外，在F1～F2代中观察到类似的改变，尽管在F2代的甲基化减弱，但显示出了潜在的跨代效应。Lei等[32]通过体外细胞实验，SiRNA干扰牛雄性生殖干细胞(mGSCs)中H19表达后，发现IGF-1信号通路能够被抑制，细胞增殖显著下降，说明H19通过IGF-1信号通路调控mGSCs的增殖与凋亡，进而影响生精功能。

四、H19与复发性流产(RSA)

RSA是指与同一配偶发生连续2次或2次以上的自然流产。流产的已知病因有染色体异常、生殖道解剖异常、内分泌失调、感染性因素、血栓前状态、自身免疫因素等。但是，临床上还有40%～80%患者找不到明确病因，称为不明原因反复自然流产(URSA)。近年来，基因表观遗传调节与URSA的关系日益受到重视。

基因芯片的研究表明，RSA患者的绒毛和蜕膜组织中多种lncRNAs与人工流产患者有显著差异[33]，这些lncRNAs可参与调控感染、炎症、内分泌、免疫等多种生理病理过程。胡炼等[34]通过检测自然流产患者和正常早孕行人工流产妇女对照者的绒毛组织中H19、E盒锌指结合蛋白1(ZEB1)的表达情况，发现自然流产组绒毛组织中H19的表达有下降趋势，受H19调控的ZEB1的表达量明显低于对照组。Hanna等[35]通过对比RSA患者与单次流产患者妊娠早期绒毛中的DNA甲基化芯片分析，发现RSA患者的H19/IGF2的印迹控制区域1(ICR1)平均甲基化水平降低。Ankolkar等[36]对比研究URSA患者配偶与已育男性的精子H19 ICR甲基化水平，发现URSA组的H19-ICR甲基化水平显著降低，说明DNA甲基化异常是除核型异常外，导致URSA的重要病因之一，而H19甲基化异常是其主要候选靶点之一。

整合素β3(ITGB3)介导细胞和基质黏附，从而控制细胞和基底膜的结合，以及细胞的游走，与子宫内膜植入窗开放和子宫内膜容受性，滋养细胞粘附入侵，以及胚胎着床密切相关。Zeng等[37]通过RT-PCR法检测H19和整合素β3的表达在体外受精-胚胎移植(IVF-ET)或冷冻胚胎移植(FET)反复植入失败(RIF)患者子宫内膜中的表达水平，结果表明，与对照组相比，RIF组H19和整合素β3表达均显著降低，推测H19/Let-7可以调控整合素β3的表达，进而影响胚胎的植入。He等[38]利用HTR-8/SVneo细胞系，探讨H19/Let-7/ITGB3轴在调节滋养细胞球体粘附和体外侵袭能力中的作用，结果表明，体外敲除H19导致ITGB3的表达降低，其粘附和侵袭能力减弱，并在RSA患者胚胎绒毛组织中，发现H19和ITGB3的表达均下降；最后通过Let-7挽救实验，以及细胞黏附和侵袭实验，证实H19/Let-7/ITGB3轴可以调控滋养层球体与子宫内膜基质细胞的黏附，影响胚胎植入和妊娠结局。但崔进等[39]的研究却得到相反结果，显示RSA组患者胚胎组织中H19的表达显著高于对照组人工流产手术患者。因此，关于H19的表达变化与RSA的关系，还有待于大样本的数据证实。

五、H19与辅助生殖技术(ART)

ART已成为人类解决生育问题的重要手段，但ART生物医学新技术的使用像一把双刃剑，在为生育带来福利的同时也会带来一系列风险。

基因印迹属于表观遗传现象，在生殖细胞中的形成主要发生于配子发育和胚胎种植前阶段，而这一阶段正是ART的干预阶段。由于印迹基因在功能上相当于单倍体，暴露于体外ART多种技术下，容易受突变的影响。因此，ART可能在配子和胚胎培养过程中干扰基因组印迹的正常表达，导致胚胎发育异常。如Beckwith-Wiedemann综合征(BWS)是由于第11号染色体短臂15.5区域(11p15.5)母源或父源性印记基因表达缺陷所致，与BWS相关的染色体印迹区域包括两个印迹域：IGF2/H19、CDKN1C/KCNQ1OT1。正常怀孕产出BWS患儿的几率是1/10 340，而采用ART助孕的母亲产出BWS患儿的概率升高至1/1 100[40]。

Market-Velker等[41]的研究表明，与体内来源的胚胎相比，所有商业培养基系统中的胚胎培养都会导致H19印迹表达的缺失，并且促排卵和胚胎培养联合处理会加剧影响H19的表达。这表明多个ART过程可累积破坏H19基因印迹，进而干扰胚胎植入前发育过程中基因组印迹的保真度。Chen等[42]研究发现，体外环境可影响基因印迹H19的维持，体外培养到第3天，被淘汰的低质量胚胎中H19基因呈现低甲基化状态。Nelissen等[43]通过检测IVF和ICSI方式获得胚胎的印迹基因甲基化水平，两组H19基因印迹控制区均存在明显低甲基化情况，随后进行的RT-PCR结果显示H19基因在IVF和ICSI组中的表达均有所增加。Cheng等[44]观察小鼠卵母细胞玻璃化冷冻对体外受精囊胚中3个印记基因差异甲基化区(DMRs)的影响，发现印迹基因H19、Peg3和Snrpn DNA甲基化丢失，其主要原因是卵母细胞玻璃化后DNA甲基转移酶减少。最新研究还表明，IVF后的胎盘发育不良与DNA甲基转移酶3β下调H19表达，导致miR675上调，激活胰岛素样生长因子信号及其下游PI3K/Akt/mTOR通路有关[45]。由此可见，ART中多个环节，包括促排卵、体外培养、ICSI、配子冷冻等技术，均可影响H19的表达，进而改变胚胎的质量和结局。

六、结语

H19在生殖道肿瘤、性激素合成、生精功能、RSA和ART中均发挥调控作用，这为生殖系统多种疾病的发病进展和诊断治疗提供了新的方向。但目前关于H19在恶性肿瘤中发挥抑癌或致癌作用仍有争议，对肿瘤细胞的增殖、迁移、侵袭等起双重作用，这可能与肿瘤类型和肿瘤微环境中均有关系，其具体机制还有待于进一步探索。H19在性激素合成方面的研究总体较少，其具体价值还需要增加相关研究。在生精功能和RSA中，H19的研究报道多集中在相关性观察，内在分子机制还需深入探讨。H19与ART的关系明确，但对于提高胚胎质量，改善妊娠结局的研究不足。但随着技术的发展和研究的深入，H19在生殖系统中的作用及机制将更加明确，有望为多种生殖系统常见病的诊断、治疗及预后评估提供可靠的依据和靶点。