梯度平衡法改善猪卵巢组织玻璃化保存效果

毕星宇，苏丹，朱鹏飞，张栋栋，武学清

(山西省妇幼保健院生殖医学中心，太原 030013)

人类生育力是人类繁衍生息、社会文明得以延续的基本推动力，是推动人类社会进步和经济发展的基础保障。随着恶性肿瘤发病率逐年增加、发病年龄逐渐降低以及生育年龄推迟等原因，对生育力保存的需求急剧增加[1]。生育力保存将是未来几年面临的重大挑战。女性生育力保存的主要方法有胚胎冷冻、卵子冷冻及卵巢组织冷冻。胚胎冷冻及卵子冷冻技术已经成熟，应用也已经非常广泛。卵巢组织冷冻技术也在近几年迅速发展，越来越多的研究者关注这项技术[2-3]，并不断改进方法，减少冻融操作对卵巢组织的损伤[4-8]。本研究观察了梯度平衡法对卵巢组织玻璃化保存效果的影响。

材料与方法

一、动物及试剂

1.实验动物：实验用猪品系为大白×长白杂交F1代，7月龄，雌性，饲养条件清洁级。实验动物伦理审批号：IRB-KYYN-2020-001。实验所用卵巢取自同一品系同月龄的3只猪，取到新鲜猪卵巢后迅速运送至实验室。将卵巢冲洗干净，小心将卵巢皮质切成2 cm×2 cm×1 mm 大小的组织片备用。

2.主要试剂：平衡液(ES，7.5%乙二醇+7.5%二甲基亚砜)、玻璃化冷冻液(VS，15%乙二醇+15%二甲基亚砜+0.5 mol/L蔗糖)、解冻液(TS，1 mol/L蔗糖)、稀释液(DS，0.5 mol/L蔗糖)、冲洗液(WS，0.25 mol/L蔗糖)。乙二醇、二甲基亚砜、蔗糖(Sigma，美国)，GB培养液(COOK，美国)，TUNEL检测试剂盒(Roche，瑞士)。

二、研究方法

1.实验分组：根据样品处理方法不同分为对照组、梯度平衡组和直接平衡组。对照组为新鲜猪卵巢，梯度平衡组采用梯度平衡法冷冻猪卵巢，直接平衡组采用直接平衡法冷冻猪卵巢。对照组和解冻后的梯度平衡组、直接平衡组卵巢组织均进行切片，HE染色和TUNEL检测。

2.卵巢组织玻璃化冷冻：(1)直接平衡法：将组织切片洗干净后置于ES平衡液里25 min。将组织切片转移到VS中放置15 min，期间可观察到组织切片沉至培养皿底部。将组织切片放置到载杆上迅速投到液氮中保存。(2)梯度平衡法：梯度平衡法是对玻璃化冷冻的第一步平衡条件进行优化。具体操作步骤为：组织片置于GB培养液中，先加入等体积ES平衡液，10 min后再加入等体积ES平衡液，10 min后将组织片置于纯ES平衡液中。其他步骤与直接平衡法一致。

3.卵巢组织玻璃化解冻：将载杆从液氮中取出并快速投到37℃预热的TS液中，将组织片轻轻剥离下来，静置1 min。将组织片转移到DS液中，静置3 min。转移到WS液中，静置5 min。再将组织片转移到新WS液中，静置5 min。然后将组织置于4%多聚甲醛中备用。

4.卵巢组织切片、HE染色及形态学观察：将组织置于4%多聚甲醛中固定，酒精梯度脱水，石蜡包埋，切片，切片厚度5 μm，连续切片，每10张切片选1张做HE染色；每张切片选取5个视野，共选取60个视野，根据Gouge on标准[9]对卵泡形态进行观察计数。统计每个视野中原始卵泡、初级卵泡正常个数及总个数。

5.卵巢组织原位末端转移酶标记(TUNEL)技术检测卵泡凋亡情况：组织切片脱蜡复水后，蛋白酶K室温孵育30 min，然后使用TUNEL试剂盒进行检测，荧光显微镜下进行观察并拍照。TUNEL阳性凋亡细胞可以观察到绿色荧光，正常细胞只能观察到细胞核DAPI蓝色荧光。组织切片每隔10张切片选取1张进行染色，染色后每张切片随机选取5个视野，共选取60个视野进行拍照、计数。

三、统计学分析

数据采用统计软件SPSS 19.0进行分析。两组形态学正常卵泡的百分率和凋亡百分率采用χ2检验分析；以P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

一、各组卵巢切片组织形态学比较

3组卵巢切片HE染色后镜下观察卵泡形态，对照组卵母细胞胞质及细胞核形态正常，颗粒细胞整齐排列在卵母细胞周围，梯度平衡组和直接平衡组的卵母细胞胞质或细胞核皱缩，颗粒细胞排列松散杂乱甚至缺失(图1)。

与对照组相比，梯度平衡组和直接平衡组的卵泡正常率均有所下降(均P<0.05)，但是这两组相比没有显著差异(P>0.05)(表1)。

A：对照组；B：梯度平衡组；C：直接平衡组；黑色箭头示异常卵泡图1 各组卵巢组织形态(HE染色 ×200)

表1 各组卵巢组织中卵泡形态正常率比较(%)

二、各组卵巢细胞凋亡率比较

3组卵巢组织切片TUNEL检测结果显示，各组均有不同程度的细胞凋亡(图2)。以梯度平衡组为例，对不同类型的细胞进行观察，发现卵母细胞、基质细胞、颗粒细胞均发生了凋亡(图3)。

分别统计3组卵巢基质细胞、颗粒细胞、卵母细胞的凋亡率，发现与对照组相比，梯度平衡组与直接平衡组的细胞凋亡率均有显著增加(P<0.05)，但梯度平衡组相对于直接平衡组卵母细胞、颗粒细胞、基质细胞凋亡率(分别为14.8% vs. 17.6%、13.8% vs. 15.2%和15.7% vs. 18.5%)均显著降低(P<0.05)(表2)。

DAPI：蓝色荧光标记细胞核；TUNEL：绿色荧光标记凋亡细胞；Merge：两种荧光叠加；scale bar=50 μm图2 各组卵巢组织TUNEL检测(×200)

A：基质细胞；B：颗粒细胞；C、D：卵母细胞；黄色箭头示凋亡细胞，白色箭头示正常细胞；scale bar=50 μm图3 梯度平衡组中不同类型细胞凋亡观察(TUNEL染色 ×400)

组 别卵母细胞凋亡率颗粒细胞凋亡率基质细胞凋亡率对照组 9.3(18/194)8.5(226/2 659)10.6(355/3 361)梯度平衡组14.8(25/169)*13.8(319/2 312)*15.7(480/3 059)*直接平衡组17.6(30/170)*#15.2(328/2 158)*#18.5(640/3 472)*#

讨 论

近年来的生育年龄后延、环境污染、恶性疾病年轻化等因素，导致人类生育力正在面临前所未有的威胁。因此，制定生育力保护策略显得尤为重要。随着人们的生活质量提高和生活方式的改变，肿瘤疾病的发病率呈逐年上升趋势，肿瘤患者保存生殖能力的需求也越来越迫切。

卵母细胞冻存、胚胎冻存、卵巢组织冻存等技术的发展为女性生育力保护提供了可行性。卵母细胞冻存及胚胎冻存技术已经成熟，并得到了广泛应用，解冻后存活率及移植妊娠率均在较高水平。但是卵母细胞冻存和胚胎冻存受配偶及性成熟的限制，采用的促排卵治疗方案也可能延误肿瘤患者最佳治疗时机。相对于卵母细胞及胚胎冷冻而言，卵巢组织冷冻不受性成熟年龄、生理周期及配偶限制，而且生育力储备大，不需要刺激卵巢、不耽误肿瘤治疗、不存在诱发肿瘤恶变的可能[10-11]，所以玻璃化冷冻卵巢组织在肿瘤患者放化疗之前的生育力保存[12-14]及卵巢早衰患者的体外激活[15]等方面有广泛的应用前景，适用于无法进行促排卵治疗和青春期前的年轻女性患者。目前，已经有很多女性通过卵巢组织冷冻保存生育力，解冻移植后成功受孕[16-17]。卵巢组织冷冻虽然可以保存大量的卵泡(主要是原始及初级卵泡)以备患者将来使用[18]，但卵巢中数以万计的原始及初级卵泡在经过冷冻解冻的过程中会受到损伤，如何减少这一过程中对卵泡造成的损伤，改善冻融效果是目前需要解决的问题。

卵巢组织玻璃化冷冻作为一个新兴的技术，越来越多的受到国内外研究者的关注，已经有研究者从冷冻载体类型、复温时间等角度研究优化玻璃化冻融效果[4-8]，但是利用梯度平衡法优化卵巢组织冷冻效果尚未见文献报道。本研究首次提出利用梯度平衡法优化卵巢组织冻融效果，并在组织形态学及细胞凋亡水平对其进行验证。在玻璃化冷冻中，平衡是非常关键的一步。平衡液中的冷冻保护剂对于细胞而言是一种高渗溶液，卵巢中颗粒细胞及卵母细胞接触到冷冻保护剂的瞬间会迅速脱水收缩，但随着冷冻保护剂进入细胞，细胞内外渗透压逐渐一致，颗粒细胞和卵母细胞会恢复原状。此过程中，高浓度的冷冻保护剂可能对细胞产生损伤，从而引起细胞凋亡。本文提出一种梯度平衡法，先让细胞接触低浓度的冷冻保护剂然后逐渐提高冷冻保护剂的浓度，最终达到细胞内外渗透压的平衡。这样就可以减缓高浓度冷冻保护剂对细胞的瞬间冲击，减少细胞凋亡率。卵巢组织冷冻的目的主要是保存卵巢中的原始及初级卵泡，原始及初级卵泡中未成熟的卵母细胞对于环境的变化极其敏感，我们采用梯度平衡法减少冷冻过程对于细胞的损伤，使冻融的效果更好。

卵巢组织切片HE染色实验发现，玻璃化冻融会影响卵巢组织形态，降低卵泡正常率，但是未发现梯度平衡法对于卵巢组织玻璃化冻融后形态学有改善效果。TUNEL检测结果发现，相对于对照组，梯度平衡组和直接平衡组卵母细胞、基质细胞、颗粒细胞的凋亡率均显著增加，说明玻璃化冷冻对卵巢组织不同类型细胞均会造成一定损伤。但是与直接平衡组相比，梯度平衡组卵母细胞、基质细胞、颗粒细胞的凋亡率显著降低，说明梯度平衡法可以降低卵巢组织冷冻过程中造成的细胞凋亡，改善玻璃化冻融的效果。玻璃化冻融对细胞凋亡的影响可能比对卵巢形态的影响更直接，所以在形态学上未反映出梯度平衡法的优势，而在细胞凋亡方面梯度平衡法效果比较显著。利用梯度平衡法可以有效减少卵巢卵母细胞、基质细胞、颗粒细胞的凋亡率，如果应用于人类卵巢组织冷冻中，就可以减少复苏后的卵巢组织细胞的凋亡。从而使重新移植回患者体内的卵巢组织更好的发育，提高患者获卵率及卵母细胞质量。

我们在本实验中初步探讨了梯度平衡法对于猪卵巢玻璃化冻融后组织形态学及卵泡凋亡的影响，发现梯度平衡法可以降低猪卵巢冻融后卵泡的凋亡率。此技术是否可以运用到人类卵巢玻璃化冷冻，对于后续卵子成熟、受精是否有影响，仍需进一步实验验证。卵巢组织玻璃化冻融技术的不断优化，将会使卵巢组织冻融在女性生育力保存方面有更广泛的临床应用前景，值得进一步深入研究。