卵巢癌细胞多药耐药中miR-193a-3p 的表达及作用

孙正伟，马蓉，徐福霞，徐汉杰，赵卫东

[1.安徽省第二人民医院妇产科，合肥 230041；2.安徽省妇幼保健院妇产科；3.中国科学技术大学附属第一医院(安徽省立医院)妇产科]

妇科癌症中死亡的主要原因之一是卵巢癌。大多数病例是隐匿发病，且没有准确有效的早期诊断方法。确诊后，70% 至80% 的患者已为晚期。目前，临床上治疗卵巢癌的标准方法是肿瘤细胞减灭术和基于铂类和紫杉醇的术后联合化疗。但是，由于肿瘤细胞存在多重耐药性，卵巢癌5 年生存率仅仅只达30%[1]。多药耐药性已成为有效治疗卵巢癌的主要障碍。为了改善卵巢癌的预后，对多药耐药机制的研究已成为关键。近年来，涉及调节肿瘤细胞对化学疗法耐受性的微小RNA(microRNAs)的研究成为热门话题。对于卵巢癌，如miR-20a[2]，miR-137[3]，miR-205[4]和miR-519a[5]等已报道与化疗耐药有关。最近的研究[6]表明miR-193a-3p 参与CD44+胃癌细胞中顺铂耐受性的调节。还未见关于miR-193a-3p 是否参与卵巢癌多药耐药性机制的研究报道。这项研究通过MTT 分析筛选出多药敏感卵巢癌细胞系及多药耐药卵巢癌细胞系。qRT-PCR检测miR-193a-3p 在上述两种卵巢癌细胞系中的表达，探讨miR-193a-3p 与卵巢癌细胞多药耐药的关系及其作用。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞系 人卵巢癌细胞系HO8910，ES-2 和SKOV-3 来源于中国科学院上海细胞研究所；A2780细胞系来自北京协和医院肿瘤细胞库。

1.1.2 主要试剂 胎牛血清(FBS，美国Invitrogen公司生产)，McCoy's 5A，RPMI Medium-1640，DMEM(美国Gibco 公司生产)；MTT(美国Sigma 公司生产)；紫杉醇(Pa，哈尔滨药业集团生产)，顺铂(Ci，江苏豪森制药有限公司生产)，卡铂(Kp，齐鲁制药有限公司生产)，多西紫杉醇(Dt，江苏恒瑞制药有限公司生产)和依托泊苷(It，江苏恒瑞医药股份有限公司生产)；miR-193a-3p mimic，miR-193a-3p 引物，the scramlble sequence(NC，negative control)和转染试剂ribo FECTTMCP 转染试剂盒购于广州瑞博生物有限公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 用包含10%FBS 的McCoy's 5A培养基培养人卵巢癌细胞系SKOV-3 和ES-2，使用包含10%FBS 的DMEM 培养基培养细胞系HO8910，并用RPMI Medium-1640 培养细胞系A2780，均培养在5%二氧化碳(CO2)，37 °C 的培养箱中。

1.2.2 MTT 法检测四种卵巢癌细胞对五种化疗药的IC50值 对数生长期的卵巢癌细胞系经胰酶消化并接种在96 孔板中。经24 h 细胞贴壁，将五种化疗药(顺铂，紫杉醇，多西紫杉醇，卡铂和依托泊苷)添加到五种梯度浓度中的每一种中。经72 h 孵育后，向每个孔中添加20 μL(5 mg/mL)MTT 试剂，并继续在孵育箱中孵育4 h。除去培养基，向每个孔中加入150 μL DMSO 以溶解甲瓒，然后轻轻摇动振荡器10 min 以完全溶解甲瓒。酶标仪使用波长570 nm 来测量吸光度(OD)值。通过Msvbvm50 软件计算与每种细胞的50%抑制率相对应的药物及浓度。重复实验3 遍。

1.2.3 定量实时PCR(qRT-PCR)法检测miR-193a-3p表达 用Trizol 法从卵巢癌细胞中提取5 μg 的总RNA 与10 nm dNTPS 1 μL 和100 nm Oligo-dT 1 μL混合。在65℃下加热5 min 后，立即将其置于冰上2 分钟。加入反转录混合物(5 X RT 缓冲液4 μL，0.1 mm DTT 2 μL，Rnase 抑制剂，反转录酶50 u)，在42 °C 反应50 min 以合成cDNA。通过在70 ℃下加热10 min 来终止反应，并在-20 ℃下保存。使用SYBR Green 方法在定量实时 PCR 仪器(FTC-3000P，加拿大丰凌生物技术有限公司)中检测miR-193a-3p 的表达水平。

1.2.4 miR-193a-3p mimic 的瞬时转染 在转染前，将卵巢癌细胞接种并在6 孔板中培养，以达到30%至50%的细胞密度。对每个孔的转染样品制备：用120 μL 1 X Ribo FECTTMCPBuffer 稀释20 μM miR-193a-3pNC/ mimic 5 μL。轻轻摇匀，加入Ribo FECTTMCP 试剂12 μL，吹打轻轻混匀，然后在室温下孵育15 min。将上述混合液体添加到1863 μL 细胞培养基中并轻轻混合。将培养板放置在37 °C 的CO2培养箱中24 h，用于从细胞中提取总RNA 并接种96 孔板，用于化疗药物对卵巢癌细胞的MTT 实验。重复实验3 遍。

1.3 统计学处理 使用GraphPad Prism 6.0 软件进行统计，α=0.01 为检验水准。ES-2(相对多药最敏感的卵巢癌细胞系)和SKOV-3(相对多药最耐药的卵巢癌细胞系)之间的miR-193a-3p 表达差异及在ES-2 细胞中转染NC 和miR-193a-3p mimic 后的miR-193a-3p 表达差异以及ES-2 细胞对四种化疗药(紫杉醇，卡铂，多西紫杉醇和依托泊苷)中每种药物耐受性的变化差异，均应用t 检验。

2 结果

2.1 MTT 法检测五种化疗药对细胞系HO8910，ES-2，A2780，SKOV-3 的IC50值 用MTT 法测定五种化疗药(紫杉醇、卡铂、顺铂、多西紫杉醇和依托泊苷) 对四种卵巢癌细胞系(HO8910、ES-2、A2780、SKOV-3)的IC50值。在排除顺铂后，从剩余的四种化疗药中筛选出ES-2(相对多药最敏感的卵巢癌细胞系)和SKOV-3(相对多药最耐药的卵巢癌细胞系)。两种卵巢癌细胞系的具体值见表1。

表1 五种化疗药对ES-2 及SKOV-3 的IC50值

2.2 miR-193a-3p 在ES-2(相对多药最敏感的卵巢癌细胞系)及SKOV-3(相对多药最耐药的卵巢癌细胞系)中的表达 结果表明，其在卵巢癌细胞系ES-2中低表达，而在卵巢癌细胞系SKOV-3 中高表达，差异有统计学意义(t=9.41，P ＜0.01)。如图1所示。

图1 qRT-PCR 方法检测miR-193a-3p 在ES-2(相对多药最敏感的卵巢癌细胞系)及SKOV-3(相对多药最耐药的卵巢癌细胞系)中的表达

2.3 miR-193a-3p mimic 可提高ES-2(相对多药最敏感的卵巢癌细胞系)对三种化疗药的耐药性 与NC 组 相 比，转 染 了 miR-193a-3p mimic 组 中miR-193a-3p表达显著升高(t=57.73，P ＜0.01)，如图2 所示。在转染NC 和miR-193a-3p mimic 后，通过MTT 方法检测ES-2(相对多药最敏感的卵巢癌细胞系)对四种化疗药(紫杉醇、卡铂、多西紫杉醇及依托泊苷)的敏感性。结果表明，与NC 组相比，转染了miR-193a-3p mimic 组中，ES-2(相对多药最敏感的卵巢癌细胞系)对三种化疗药(紫杉醇、卡铂、多西紫杉醇)的耐药性显著提高(除依托泊苷外)，差异有统计学意义(t=6. 05，P ＜0.01；t=4.23，P ＜0.01；t=9.19，P ＜0.01)，如图3 所示。

图2 qRT-PCR 方法检测ES-2(相对多药最敏感的卵巢癌细胞系)转染NC 及miR-193a-3p mimic 后miR-193a-3p 的表达

图3 MTT 方法检测在ES-2 (相对多药最敏感的卵巢癌细胞系)中转染NC 和miR-193a-3p mimic 后对四种化疗药的敏感性

3 讨论

目前，有效治疗卵巢癌的主要障碍为化疗耐药，特别是多药耐药[7-8]。近年来，对卵巢癌化疗耐药机制的研究成为一个热门话题[9]。例如，MicroRNAs(miRNAs)是一组非编码的小RNA，它们在转录后水平上调节蛋白质编码基因的表达，并参与肿瘤细胞的增殖、分化、侵袭、转移和代谢以及多药耐药等[10]。而有关miR-193a-3p 的研究团队表明，miR-193a-3p可以通过在体内外抑制SRSF2，PLAU，LOXL4，HIC2，HOXC9，ING5 和PSEN1 的表达来调节NF-kB，DNA 损伤，Oxidative stress，Notch 和Myc/max 五个信号通路，提高了膀胱癌对多种化疗药的耐药性[11-12]，并初步证实miR-193a-3p 的表达同4种化疗药(吡柔比星，阿霉素，羟基喜树碱和盐酸表柔比星)的耐药性密切相关，而最近有研究[6]报道，miR-193a-3p 参与CD44+胃癌细胞对顺铂的耐药机制调节。目前为止，有关miR-193a-3p 在卵巢癌化疗耐药中的机制研究较少。

在这项研究选择了四种卵巢癌细胞系(HO8910、ES-2、A2780、SKOV-3)作为研究对象，并依据最新的NCCN 指南从第一线化疗药中选择了顺铂、卡铂和紫杉醇。并从第二线化疗药中选择了依托泊苷和多西紫杉醇。用MTT 法测定5 种化疗药(紫杉醇、卡铂、顺铂、多西紫杉醇和依托泊苷)对4种卵巢癌细胞系(HO8910、ES-2、A2780、SKOV-3)的IC50值。在排除顺铂后，从剩余的四种化疗药中筛选出ES-2(相对多药最敏感的卵巢癌细胞系)和SKOV-3(相对多药最耐药的卵巢癌细胞系)。用qRT-PCR 检测miR-193a-3p 在ES-2(相对多药最敏感的卵巢癌细胞系)及SKOV-3(相对多药最耐药的卵巢癌细胞系)中的表达。结果表明，miR-193a-3p在卵巢癌细胞系ES-2 中低表达，而在卵巢癌细胞系SKOV-3 中高表达。于是，将NC 和miR-193a-3p mimic 转染到ES-2(相对多药最敏感的卵巢癌细胞系)中，并使用qRT-PCR 检测转染效率，与NC 组相对比，转染了miR-193a-3p mimic 组中miR-193a-3p表达相对增加约3 258 倍。进而，在转染NC 和miR-193a-3p mimic 后，通过MTT 方法检测ES-2(相对多药最敏感的卵巢癌细胞系)对4 种化疗药(紫杉醇，卡铂，多西紫杉醇及依托泊苷)的敏感性，与NC 组相对比，转染了miR-193a-3p mimic 组中，ES-2(相对多药最敏感的卵巢癌细胞系)对3 种化疗药(紫杉醇，卡铂，多西紫杉醇)的耐药性显著提高(除依托泊苷外)。这与关于胃癌[6]、肝细胞肝癌[13]和膀胱癌[11-12]的文献中的报道结果相似。未来的研究重点在于：进一步探究miR-193a-3p 是通过作用哪些下游的蛋白编码基因来参与卵巢癌的多药耐药机制的调节。

综上所述，miR-193a-3p mimic 可以增加ES-2(相对多药最敏感的卵巢癌细胞系)对卡铂，紫杉醇和多西紫杉醇的耐药性。这可能为判断卵巢癌患者的预后提供新的分子标志物，并选择敏感的化疗药，可能为将来对卵巢癌的多药耐药性或基因靶向治疗的基础或临床研究提供新思路。