肌肉蛋白乳化特性改善方法研究进展

李丽湲，赵 雪，徐幸莲

（南京农业大学食品科技学院，国家肉品质量安全控制工程技术研究中心，江苏南京 210095）

乳化是指将一种液体以微小的液滴或球状均匀地分散到另一种与之不相溶的液体中的过程。其中，微小液滴状的液体称为分散相或不连续相，承载不连续相的液体为连续相。乳状液是食品生产加工中常见的分散体系，为了得到稳定体系，乳化剂的添加是关键步骤。大部分蛋白质具有两亲性，同时含有亲水和疏水氨基酸，可以在乳化过程中吸附到油水界面形成蛋白膜，通过静电排斥作用减少液滴聚集，从而提高乳状液稳定性，是一类良好的天然乳化剂[1]。蛋白类乳化剂不仅能够在食品体系中表现出良好的乳化特性，而且其来源丰富，绿色环保，食用安全，生物可适性高，因此在食品领域广泛获得加工企业及消费者的青睐。

由于肌肉蛋白具有良好的乳化特性，因此在乳化类肉制品生产加工中承担乳化剂作用。在温度、pH、离子强度等环境因素的作用下肌肉蛋白结构会发生改变，表面电荷和表面疏水性的改变会破坏界面蛋白膜形成秩序[2]，导致乳液稳定性变差。胡爱军等[3]指出由鱼肉蛋白制备乳液，其乳化性及乳化稳定性随着温度的升高呈现先增加后降低的趋势，高温会引起蛋白质变性，降低界面蛋白膜的粘度和硬度，造成乳液失稳。鱼肉在冷冻贮藏过程中，其肌原纤维蛋白也会不断发生氧化、变性和交联，导致乳化粒子减少，乳化稳定性下降[4]。此外，乳化类肉制品一直以来存在出油出水问题，通过提高肌肉蛋白乳化特性改善肉制品乳化凝胶品质是肉制品行业长期以来的热点问题[5]。近年来，为了提高肉制品的健康特性，研究者探索了多种手段尝试采用不饱和脂肪酸含量较高的植物油脂代替传统乳化类肉制品中的动物油脂[6]。由于植物油脂具有不饱和脂肪酸含量高和易流动等特点，直接替代动物油脂可能会导致质构和感官品质的大幅下降[7]，因此新型健康乳化肉制品的生产加工对肌肉蛋白的乳化特性提出了更高的要求。目前，已有研究表明超高压[8]、超声波[9]、糖基化[10]和酸碱处理技术[11]等蛋白修饰处理技术均可以有效改善蛋白质的乳化特性。蛋白质经处理后发生变性，空间结构改变，更多埋藏于蛋白内部的疏水基团暴露，二级结构的含量也会发生变化，趋向于形成更不规则的结构，蛋白质结构展开，彼此间相互作用增强，有利于界面蛋白膜形成。

本文简要论述了一些肌肉蛋白乳化特性的改善方法，以期为肌肉蛋白乳化特性的提升提供新的思路和方法，为乳化产品的品质改善和新产品的开发应用提供理论依据。

1 肌肉蛋白乳化特性及其影响因素

1.1 肌肉蛋白乳化特性

基于肉制品加工中肌肉蛋白乳化特性的研究，学者们提出了两种不同的乳化理论[12−14]：一是水包油型乳化学说，该学说认为脂肪颗粒为不连续相分散在蛋白溶液中，并且在脂肪球的表面包裹着一层蛋白质，有效地阻止了脂肪球的聚集以使乳化体系稳定；一是物理镶嵌学说，肌肉在绞碎、斩拌过程中萃取出的蛋白质、纤维碎片、肌原纤维及胶原纤丝间发生相互作用，形成黏稠的蛋白基质，脂肪颗粒被包裹在基质中形成相对稳定的乳化体系。脂肪球周围界面蛋白膜的形成以及黏稠蛋白基质的存在都可以减少脂肪液滴的聚集与絮凝以维持乳化体系稳定，两种理论在不同体系中均有一定适用性[15]。

乳化特性作为肌肉蛋白的重要功能特性之一，与肉制品的产品质量密切相关。肌肉蛋白具有乳化剂特有的两亲性结构，可以同时与油相和水相作用，吸附在水油界面形成蛋白层，降低油相表面张力，保证乳化体系形成并保持其稳定。其中起主要作用的是肌球蛋白[16]，肌球蛋白由球状头部和长杆状尾部组成，头部的空间结构及尾部的超螺旋结构表现出不同的疏水性，尾部疏水残基较少，亲水性较强[17]，头部疏水性较强，二者达到亲水亲油平衡有利于蛋白质吸附至油水界面形成界面膜以稳定乳液。肌肉蛋白的乳化特性可以分别通过乳化活性（emulsifying activity index，EAI）和乳化稳定性（emulsion stability index，ESI）进行评价。乳化活性指的是乳化过程中蛋白质吸附到油相和水相界面的能力[18]，即单位质量蛋白质（g）所能稳定的油水界面面积（m2）；乳化稳定性则代表在贮存或加热过程中蛋白质维持乳液体系稳定不分层的能力[19]，二者通常采用浊度法[20]进行测定。不同种类肌肉蛋白其来源、种类特性及成分不同，所以乳化特性有所差异，有研究表明分别由猪肉、牛肉和鸡肉制备的肌原纤维蛋白乳化能力显著不同，鸡肉蛋白乳化能力最高，牛肉最低，这主要是因为鸡肉肌原纤维蛋白的溶解性更好，更多蛋白质参与界面膜的形成[21]。杜菲菲等[22]在不同种类肉肌浆蛋白也发现相似的结果，鸡肉肌浆蛋白EAI最高，鱼肉肌浆蛋白EAI显著低于鸡肉和猪肉。

1.2 主要影响因素

影响肌肉蛋白乳化特性的因素有许多，包括蛋白质种类、来源和氨基酸分布等内在因素和温度、pH、离子强度等外界环境因素，其中，外界环境能够通过引起蛋白质自身结构与聚集程度改变[23]，从而影响其乳化能力。因此，肌肉蛋白的溶解度、粒径分布、巯基分布、疏水基团分布等结构以及聚集程度变化对其乳化特性有重要影响。

1.2.1 溶解性 溶解性是指蛋白质在极性溶剂水中的溶解程度，通常蛋白质在发挥其界面性质作用之前，需要先溶解并移动到界面，因此，溶解性是评价蛋白质可应用性的重要指标之一[24]。通常，肌肉蛋白溶解度越大，越有利于蛋白质分子迅速扩散并吸附在油水界面形成蛋白膜包裹脂肪球，阻止脂肪球之间的聚合，从而起到乳化效用[25]。肌肉蛋白的溶解性主要与蛋白质的分子大小和表面电荷相关[26]。表面净电荷越多时静电作用越显著，静电斥力使蛋白质分子不易聚集趋向解离，从而增加溶解度。吴菊清等[27]研究猪肉肌原纤维蛋白的乳化特性，发现蛋白的溶解度与乳化能力显著正相关，随着环境介质离子强度增加，蛋白溶解度提高，其乳化性和保水保油性等加工特性随之增加。

1.2.2 粒径分布 蛋白质的平均粒径可以表征蛋白质的尺寸大小和聚集程度，也可以反映蛋白质空间构象的变化。通常蛋白质分子之间发生聚集沉淀时粒子直径明显增大，当蛋白分子间的交联被破坏时平均粒径减小[28]。粒子直径降低，比表面积增大，蛋白质分子之间的相互作用增强，有利于蛋白质吸附至油水界面形成致密稳定的界面膜，降低表面张力，稳定乳状液[29]。

1.2.3 巯基含量 巯基是肌原纤维蛋白中最具活性的功能基团，暴露于蛋白表面后易被氧化形成二硫键，从而引起蛋白质交联[30]，蛋白质之间的相互作用增强，有利于界面蛋白膜的形成，提高界面膜厚度，从而有效防止液滴之间发生聚集及絮凝，稳定脂肪的能力提高，乳状液稳定性得以改善。因此活性巯基含量增加有利于改善肌肉蛋白的乳化特性。Wu等[31]用n-乙基马来酰亚胺处理由肌原纤维蛋白稳定的乳状液发现，n-乙基马来酰亚胺阻断巯基形成二硫键后，油滴与周围蛋白质的相互作用显著减弱，造成乳化液滴稳定性下降。用β-巯基乙醇处理猪肉蛋白溶液也有相似的发现[32]，自由巯基的含量随化学修饰剂用量的增加而增加，但乳化稳定性却逐渐降低，这可能是因为β-巯基乙醇的添加阻碍了二硫键的形成，使得蛋白分子间的相互作用减弱，从而削弱了蛋白质稳定脂肪的能力。

1.2.4 表面疏水性 表面疏水性是评价蛋白质表面活性的重要指标，它可以间接表征蛋白质结构变化以及变性程度。表面疏水性反映蛋白质分子内部疏水基团的暴露程度，暴露程度越大，疏水性越强，与脂肪的相互作用增强，包裹脂肪球的蛋白质数量随之增多[33]。但疏水基团过度暴露会导致蛋白表面疏水性显著增强，强的疏水作用使蛋白质之间相互靠近，易发生蛋白聚集[32]，因此，肌肉蛋白中疏水基团的适当暴露有利于维持油水界面蛋白质膜的稳定，增加乳状液稳定性。

2 肌肉蛋白乳化特性改善方法

目前，改善肌肉蛋白乳化特性的方法可以分为物理方法和化学方法。物理方法主要有高压均质技术、高静压技术、超声波技术、微波处理技术和等离子体技术等；化学方法有糖基化修饰和酸碱处理等。这些处理手段的施加会引起蛋白质自身结构变化或蛋白聚集程度改变，从而在一定程度上改善肌肉蛋白的乳化特性。

2.1 物理方法

2.1.1 高压均质技术 高压均质（high pressure homogenization，HPH）是一种非热加工技术，在食品领域已有广泛应用。物料在高压作用下通过具有特殊构造的均质腔，同时受到高速剪切、高频振荡、空穴效应和对流碰撞等物理作用，从而起到微乳化、超微化、均一化等效果[34−35]。经HPH处理后乳化剂颗粒直径减小，使得比表面积增加，颗粒间的相互作用增强，体系表观粘度增加，从而有效降低液滴的悬浮速率，从而更好地保持乳液的稳定性。Saricaoglu等[36]提取去骨鸡肉蛋白，施加不同均质压力处理蛋白样品，研究HPH对蛋白功能特性的影响。结果表明施加压力为75 MPa时，粒子直径高于500 μm，而压力升至100及150 MPa时，蛋白粒子直径显著降低，降至10 μm以下。机械外力减小了粒子尺寸，增加了比表面积，乳化颗粒与水之间的相互作用增强，从而使蛋白的乳化特性得到改善。HPH强烈的物理作用不仅能够改变蛋白的聚集程度，还会引起蛋白结构的改变。Chen等[37]研究了低离子强度条件下HPH对鸡肉肌球蛋白构象的影响，在103 MPa压力处理下，蛋白结构发生明显改变，表面疏水性显著增加，更多巯基暴露于蛋白表面，α-螺旋含量显著降低，同时溶解度显著增大。研究表明HPH的多种物理作用能够破坏肌原纤维蛋白高度交联的复杂结构，大幅提高其溶解性，进而改善肌原纤维蛋白乳化能力[38]。

2.1.2 高静压技术 高静压技术（high hydrostatic pressure，HHP）又被称为超高压技术（ultra-high pressure processing，UHP）或高压技术（high pressure processing，HPP），是食品加工领域中常用的非热加工技术之一。高静压作用于肌肉蛋白会使得蛋白质受到物理压缩，天然结构发生改变[39]，蛋白质的溶解性、乳化特性和凝胶性等功能特性均发生变化。通常情况下，施加压力范围在100~1200 MPa时，水分子在高压作用下侵入蛋白质基质内部引起蛋白质变性，压力水平不同，蛋白质变性程度不同[40]。压力低于200 MPa时仅蛋白质的三级和四级结构受到破坏，但经处理后可恢复蛋白质天然结构，属于可逆变性；压力高于300 MPa则会引起蛋白质二级结构改变，发生不可逆变性[41]。Li等[42]提取口虾蛄肌原纤维蛋白并用300、350和400 MPa处理不同时间，发现随着处理压力的增大以及处理时间的延长，离子键和氢键被破坏程度增加，分子间相互作用改变，疏水相互作用和二硫键加强，肌原纤维蛋白发生一定程度变性。该压力范围内蛋白质二级结构发生不可逆变性，分子结构部分展开，有利于界面蛋白膜形成。然而蛋白的变性程度与处理压力并非始终成正比，才卫川等[43]研究了更大压力范围内（200~800 MPa）超高压对鸡胸肉盐溶蛋白功能特性的影响，发现盐溶蛋白的乳化活性及乳化稳定性随压力增大而显著提高，且在400 MPa时达到最大值，这可能是由于高压引起疏水基团适当暴露使蛋白分子更易于吸附至油水界面，从而改善盐溶蛋白的乳化特性；而当压力高于400 MPa时，蛋白质变性程度加剧，蛋白分子聚集沉淀，界面蛋白膜因可溶蛋白数量减少而不完整，乳化稳定性随之降低。

2.1.3 超声波技术 超声波作为一种安全、无毒、环保的新型加工技术，在食品等领域得到广泛应用。声波与介质相互作用会引发一系列理化效应，如空穴效应、机械效应和热效应等[44]。超声波的机械频率高于人们可听到的频率，其中低频率超声[45]（16~100 kHz），强度高，可以用来改变食品的物理和化学特性。Li等[46]采用频率为20 kHz、功率为450 W、强度为30 W/cm2的超声波分别处理鸡肉肌原纤维蛋白悬浊液0、3和6 min，研究发现超声波处理6 min显著提高了肌原纤维蛋白的乳化活性和乳化稳定性。这是由于超声处理减小了蛋白分子直径，增强了蛋白质与油滴或蛋白质与蛋白质之间的相互作用，从而使乳化体系稳定性增加。此外，超声也促进了肌原纤维蛋白的去折叠，使得活性巯基含量和表面疏水性均显著增加，α-螺旋含量减少，蛋白质结构的展开更利于其吸附至油水界面，因此显著提高了肌原纤维蛋白的乳化特性以及乳液的贮藏稳定性。Amiri等[47]用100和300 W超声波处理牛肉肌原纤维蛋白得到相似的结果，随着超声波功率的增加和处理时间的延长，肌原纤维蛋白的乳化活性和乳化稳定性均呈增加趋势，可能是超声波空穴效应的物理作用力破坏了液滴的聚集，显著降低了粒子直径，增加了比表面积，更多的蛋白质分子参与界面层的形成；同时表面疏水性增大，蛋白质分子更有效地吸附于两相界面，从而显著改善蛋白质的乳化特性。Zou等[48]研究了100、150和200 W超声波处理对肌动球蛋白理化特性及功能特性的影响，研究表明150 W超声处理后肌动球蛋白的粒子直径最小，绝对电势最高，表面疏水性及活性巯基含量显著增加，蛋白质的溶解度及乳化特性得到显著提高。总体而言，超声的空穴效应和机械效应显著降低了粒子平均直径，通过形成致密稳定的界面蛋白膜以改善乳液稳定性。

2.1.4 微波处理技术 微波是指频率范围300 MHz~300 GHz的电磁波，能够使物料中的极性分子发生振动从而对自身结构产生一定的影响[49]。微波技术安全高效，在食品领域有广泛应用，包括灭菌、干燥、烘焙等。胡爱军等[3]用超声、微波、加热三种方式处理鲢鱼蛋白，比较不同方式对蛋白乳化性的影响，研究发现相较于超声和热处理，微波处理对鱼肉蛋白乳化性能的改善作用更显著。用不同微波功率（0~500 W）处理鱼肉蛋白30 s，随着功率的不断增大，蛋白的乳化性和乳化稳定性呈先增大后减小的趋势；用相同微波功率处理不同时间，随着时间的延长也出现同样的结果。出现增大趋势可能是微波场使蛋白分子发生极化现象，蛋白分子空间结构被破坏而部分展开，疏水残基暴露增加，蛋白分子更易于吸附至油水界面，从而有效增强了蛋白质的乳化性和乳化稳定性。而微波功率过高、时间过长会引起蛋白质热变性，不利于界面蛋白稳定，因此乳化特性达到最大值后呈现下降趋势。李瑞平[50]采用800 W微波处理草鱼肌浆蛋白0~10 min，经荧光光谱分析发现，随着处理时间的延长，蛋白分子的表面疏水性呈上升趋势，内源荧光强度呈下降趋势，这可能是因为微波使蛋白分子原有结构被破坏，蛋白分子展开，部分原本包埋在分子内部的疏水基团暴露，疏水性增强，色氨酸和酪氨酸等发色基团暴露在溶剂中发生荧光猝灭。这与胡爱军[3]的研究结果并不完全一致，可能是因为蛋白种类以及微波功率不同而造成的差异。但二者的结果均显示在一定处理条件下，微波可以改变肌肉蛋白的分子结构从而改善其乳化特性。

2.1.5 等离子体技术 等离子体是部分或全部电离的气体，其正电荷数和负电荷数在数值上相等，所以称之为等离子体，包括离子、电子、活性自由基等带电粒子[41]，这些带电粒子能量很高，可以激发一系列化学反应。当气体分子不断发生电离，电子和离子的浓度达到一定范围后，物质的状态就会发生根本性变化，性质也随之改变，区别于物质的固、液、气三态，称之为物质第四态[51−52]。Ekezie等[53]用大气压等离子体处理明虾肌原纤维蛋白并研究其构象和理化特性的改变，结果发现随着处理时间延长，蛋白的表面疏水性呈增加趋势，这可能是因为蛋白发生氧化，苯丙氨酸和色氨酸等疏水氨基酸暴露，同时蛋白质的二级结构α-螺旋含量显著降低，蛋白结构展开，从而改善了其乳化特性。在另一研究中其采用氩等离子体技术处理明虾肌动球蛋白得到了相似的结果，天然的肌动球蛋白经过氩等离子体处理5 min后EAI值显著增加，蛋白结构展开暴露出更多的疏水基团[54]，疏水性提高，包裹脂肪的能力增强。等离子体中的活性氧成分对巯基和氨基酸残基有氧化作用，能够诱导蛋白分子展开，使原本藏于蛋白结构内部的活性基团及疏水基团暴露，从而引起蛋白结构与功能的改变。

2.2 化学方法

2.2.1 糖基化修饰 糖基化是广泛存在的一种蛋白质翻译后修饰，受到修饰的氨基酸残基一般包括苏氨酸、丝氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺等。糖基化修饰的本质是美拉德反应中Amadori重排，即还原糖分子中的羟基与蛋白质分子中的赖氨酸残基共价结合形成糖基化蛋白[55]。天然蛋白质经糖基化修饰后可以避免蛋白分子聚集，而且糖类中的亲水基团可以增加糖基化蛋白的溶解性，从而改变蛋白的功能特性[56−57]。Xu等[58]用葡聚糖对肌原纤维蛋白进行糖基化修饰，研究该处理对蛋白质的结构和乳化性的影响，发现糖基化后的蛋白多糖聚合物表面疏水性降低，结合浊度和活性巯基的含量变化，表明糖基化肌原纤维蛋白发生去折叠，结构松散，乳化活性和乳化稳定性显著增加。采用20、40和70 kDa的葡聚糖分别修饰肌原纤维蛋白，结果显示70 kDa修饰后的蛋白乳化性最好，可能是大分子量的多糖基团能够有效阻止了蛋白分子的聚集。陈欣[59]用小分子还原糖（葡萄糖和乳糖）以及分子量较大的壳聚糖、葡聚糖和羧甲基纤维素钠作为糖基供体修饰罗非鱼肉肌原纤维蛋白得到了相似的结果，小分子还原糖对肌原纤维蛋白的乳化特性改善作用不明显，相比较而言，葡聚糖作为糖基供体的产物乳化活性显著提高。Liu等[60]研究了魔芋寡糖-葡甘露聚糖糖基化修饰对鲢鱼肌球蛋白的理化特性、构象和功能特性的影响，发现肌球蛋白经糖基化修饰后三级结构部分展开重排，EAI和ESI值显著增加，糖链形成一定的空间位阻破坏蛋白质之间的交联凝聚，因此肌球蛋白乳化性增加。总而言之，经糖基化修饰的蛋白质分子由于大分子量的多糖基团存在，彼此之间难以靠近聚集，同时溶解性也显著增加，使得其形成的乳液体系更加稳定。

2.2.2 酸碱处理 酸碱处理（isoelectric solubilization/precipitation，ISP）是一种蛋白提取技术，又可称为pH-shifting，通过调整蛋白质溶液的pH，使蛋白质分子在偏离其等电点时溶解，在其等电点附近沉淀，从而获取蛋白质，具有提取时间短、分离效率高、蛋白质变性程度小、安全系数高等特点[61]。酸碱处理导致的极性环境会引起蛋白质部分解折叠，原本藏于分子内部的部分疏水基团暴露于分子表面，表面疏水性改善，同时蛋白分子的解折叠过程还会影响其复折叠后的功能特性。在解折叠与复折叠的过程中，蛋白质会产生一种新的结构状态，将其命名为“熔融态球体”[62−63]。熔融态蛋白质分子具有与天然态相似的二级结构，结构紧凑，疏水性较天然态更强，更易与非极性分子结合，表现出更加良好的溶解性、乳化性、起泡性、凝胶性和抗氧化活性等[64]。Hrynets等[65]研究发现鸡肉蛋白在解折叠过程中会使分子内部的疏水基团充分暴露，有利于蛋白质和非极性油滴表面相互作用，降低吸附能垒，从而包裹油滴形成稳定的界面蛋白膜，维持乳液稳定。同时发现用碱法提取的蛋白表面疏水性显著高于酸法提取，碱性环境使更多的疏水区域暴露于蛋白表面，蛋白结构展开，更有效地吸附至油水界面，因此乳化稳定性明显得到改善。Abreu等[66]在对虾副产物蛋白研究中得到相似结果，pH3条件下未发现分离蛋白有乳化能力，随着pH远离其等电点，蛋白乳化能力不断增加且在pH8时达到最大值。Zhao等[67]研究了碱法分离分离蛋白稳定的O/W乳状液的流变特性及物理特性，其用ISP技术提取类PSE鸡肉蛋白，在pH11.0处溶解蛋白，在pH5.5处使蛋白沉淀，结果发现与对照组相比，ISP分离蛋白疏水基团暴露增加，更易于吸附至油水界面，而油滴被蛋白质包裹后彼此间排斥力增强，有效阻止了油滴聚集，从而表现出更好的乳化能力，形成更稳定、均一的乳液。

3 展望

肌肉蛋白的乳化特性在乳化类肉制品的生产加工中起重要作用。综上所述，多种物理和化学方法在适当条件下通过改变蛋白结构与聚集程度均可以有效地改善肌肉蛋白的乳化特性。然而目前，针对肌肉蛋白乳化特性的研究主要集中在乳化特性的单一改善方案、影响因素以及评价方法等方面。关于肌肉蛋白乳化特性复合改善策略和机理还需要深入研究。此外，改善方案的实施会一定程度地影响肌肉蛋白的感官特性，对蛋白质的应用范围产生一定的限制，因此减少改性对蛋白质感官特性的影响也是后续研究的方向。另外，改善后的肌肉蛋白的食用安全性也值得进一步关注。随着食品的不断创新、开发，肌肉蛋白乳化特性的应用也将有更广阔的市场，继续探索发现有效、便捷、安全的改善蛋白质乳化特性的方法具有良好的发展前景。