食用酵素发酵代谢及功能特性研究进展

蔡丽琴，王伟军 ，李延华，林蒙蒙，方鲁平

（1.浙江工商大学食品与生物工程学院，浙江杭州 310018；2.浙江一鸣食品股份有限公司，浙江温州 325000）

食用酵素产品起源于日本，始于二十世纪初，现流行于日本、台湾、欧洲等地，一般以乳酸菌（Lactic Acid Bacteria，LAB）、酵母菌、醋酸菌等益生菌协同作用于果蔬、食用菌、药食同源植物、动物等原料而成，成品含有一定量多糖类、多酚类、蛋白质类、氨基酸类、维生素类等生物活性成分[1]。食用酵素按产品形态分类包括液态、膏状和粉末状产品；按生产工艺分类包括纯种发酵酵素、群种发酵酵素和复合发酵酵素；按发酵原料分类包括植物酵素、菌类酵素、动物酵素和混合酵素[2]。食用酵素与其他发酵产品的区别主要有以下几点：（a）制作前期微生物发酵需要氧气，成品几乎不含酒精；（b）原料前处理简单，发酵流程少；（c）发酵周期长，一般为1个月至两年[3−7]。中国早在4000多年前，就已有豆豉、辣椒酱等这一类与食用酵素极为相似的传统发酵产品，但国内有意识的开发功能性酵素产品较晚。食用酵素发酵过程流程少，原料经基本的清洗消毒切片加入配料后直接发酵，区别于需要制曲、糖化等发酵前处理的酒、醋；根据发酵周期的不同，其与酸奶等产品也有所区别[3]。

食用酵素是通过微生物代谢产生一系列酶并作用于原料而成的，日本在发明此类产品初期也将“酶”字命名进其名称中——植物的酶（或发酵）的提取物，后逐渐被简化成为“酵素”[1]。在汉语和日语中，“酵素”曾有两个意思，即发酵产物和酶，现在一般指发酵产物。酶本质上是蛋白质，口服补充后大部分在人体内被分解，通过摄入外源酶几乎不能补充人体相应的内源酶，但也有例外，如超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）在欧美、日本等国家已经被用作预防衰老相关疾病和抗衰老的膳食补充要素之一[1]。酵素可以补充酶主要是因为酵素中的一些功能性成分促进了人体内源酶的分泌。

食用酵素中含有丰富的维生素、酶、矿物质和次生代谢产物等营养成分，是一种具有潜在保健功效的新型食品。近年来国内也开始工业化生产酵素，但酵素行业是个新兴行业，业内法规制度仍有欠缺，食品安全性有待提高。因此，研究酵素产品的发酵机理、发酵过程中微生物的代谢产物、食用酵素的功能特性，分析酵素行业存在的具体实际问题具有重要意义。本文着重介绍了食用酵素制作过程中的发酵机理，综述了食用酵素潜在的功能以及目前食用酵素产品存在的问题，为促进食用酵素行业发展提供一定理论参考。

1 食用酵素发酵机理

食用酵素是原材料在适宜辅料添加量、一定温度下通过微生物发酵形成的，其制作过程如图1。在发酵过程中根据发酵周期的长短可将食用酵素分为发酵液、发酵提取液、酵素发酵液这3种具有不同用途的原液（如表1）[8]。发酵液和发酵提取液保留原料新鲜口感以及活菌，保质期短；酵素发酵液口感香醇且其生物活性物质含量高，保质期长。食用酵素的浓度和品质与所使用的发酵原料种类和数量具有一定的正相关性[3]，合适的、具有互补功效的多原料发酵可使产品含更丰富的营养元素，酵素原料经微生物发酵后一部分固有的营养物质保留，另一部分经代谢产生了一系列新的生物活性成分或含量得到累积增加，如多酚、多糖、有机酸、SOD、蛋白酶、脂肪酶、纤维素酶等。酵素发酵过程中的代谢反应不仅与发酵原料以及发酵条件有关，也与微生物的相互作用有关，食用酵素发酵中微生物通过其自身的物质代谢使发酵原料在分子水平上发生分解和结构改变，产生很多复杂的中间代谢或交叉代谢产物。Minnaar[9]等研究发酵樱桃汁和花椰菜泥酚类物质代谢途径表明，由于所选的细菌的生物转化作用，这两类发酵产物富含具有高人体生物利用度的酚类衍生物。游离咖啡酸在胃和小肠中的吸收比绿原酸好，然而只有结肠微生物群能够水解绿原酸以释放咖啡酸[10]，食用酵素微生物在体外实现了这一转化，这可能提高这些水果和蔬菜基质的固有功能价值。先前也有研究表明，乳酸菌降解酚酸是一些化合物解毒的重要机制[11]。例如，银杏核中潜在的有毒成分已被鉴定为银杏酚酸，其经LAB发酵后银杏酚酸降解率达70%以上，发酵48 h后，银杏仁汁中银杏酚酸的最终浓度低于1 mg/L[12]。红茶菌酵素是一种以茶叶作为原料发酵的酵素，Reiss等[13−14]在研究以蔗糖作为碳源的红茶菌酵素的发酵过程中发现酵母菌和细菌会通过糖代谢优先分解蔗糖为果糖和葡萄糖，酵母菌再利用果糖代谢产生乙醇，醋酸菌将乙醇转化为醋酸，同时葡萄糖被醋酸菌转化为葡萄糖酸，证明在红茶菌酵素的发酵过程中酵母菌与醋酸菌是互利共生关系。

图1 食用酵素制作流程图Fig.1 Production process of edible ferment extract

表1 不同发酵时间酵素液分类及特性Table 1 Classification and characteristics of fermented juice by different fermentation time

食用酵素发酵过程一个通氧周期内微生物变化大致为：起初典型的兼性厌氧酵母菌需氧发酵并大量增殖，将大分子的糖发酵成葡萄糖、果糖、乙醇等，当氧气逐渐被耗尽时，醋酸菌将酵母菌产生的酒精转化成乙酸，同时乳酸菌在无氧条件下将葡萄糖或乳糖转化成乳酸等有机酸。两种产酸菌开始生长，酵母菌数量开始减少，一个通氧周期快结束时，乳酸菌、醋酸菌为优势菌，一般乳酸菌发酵饮料比酵母菌发酵饮料有更低pH和乙醇体积分数[15]。在苹果酵素自然发酵过程中，苹果酸会被体系中少量的乳酸菌通过苹果酸发酵途径代谢生成乳酸和CO2，并影响总酚含量的变化[16]。

食用酵素产品加工后期也像许多发酵食品如酸奶、酒、食醋等一样存在后熟过程。液态发酵食醋后熟原理是利用水解酶类在短时间内将醋醪中的蛋白质、多糖等物质水解成氨基酸类或蛋白质中间产物、单糖或双糖等，一些合成酶类也发挥着作用，将一些简单的有机物合成大分子的物质，酶褐变反应与美拉德反应同时进行，增加了色泽。在较低温度条件下进行后熟，各种反应进行的缓慢，风味物质生成的较多，口感醇厚柔和。食用酵素后熟过程中也经历着如食醋般的生化变化，但深入的机理至今仍鲜有报道，其完成发酵阶段后经一段时间的低温密封保存使得风味改善、色泽增加、澄清度提高、刺激性减少。

2 食用酵素基质中的微生物组成分析

食用酵素选用的原材料在LAB、酵母菌、醋酸菌等益生菌的作用下可以改善发酵基质原有的一些不良风味并产生一些新的功能成分。在传统食用酵素的制作过程中不同的原材料配伍可以变化出不同种类的食用酵素，其微生物组成也不尽相同，但整个食用酵素微生物体系的构成又遵循一定规律。现代发酵工业将优势有益菌接种到发酵体系中来优化发酵产品质量，在酵素食品加工体系中添加优势微生物可快速构建出有益的微生物生态，抑制腐败菌、致病菌等杂菌的生长[17]。

2.1 传统食用酵素中的微生物

传统食用酵素微生物组成的测定一直是食品界学者关注的热点。根据生鲜蔬菜和水果种类的不同，其表面所含的微生物种群在5.0~7.0 logCFU/g之间波动，微生物区系主要为隐球菌属（Cryptococcus）、假丝酵母属（Candida）、酵母菌属（Saccharomyces）、毕赤酵母属（Pichia）、汉森诺拉属（Hansenula）、德巴罗米斯属（Debaromyces）和红酵母属（Rhodotorula）。水果的微生物区系以酵母菌和真菌为主，酵母菌的范围在2.0~6.0 logCFU/g之间，LAB在2.0~4.0 loogCFU/g之间。蔬菜的微生物群以细菌群落为主，尤其是假单胞菌（Pseudomonads）、肠杆菌（Enterobacteria）和棒状芽孢杆菌（Coryneforms）等需氧菌，生蔬菜中也可能存在凝固酶阳性葡萄球菌和其他粪便细菌[18]。因此，相比于现代工业发酵技术接种固定菌种，传统发酵产品因所含菌种的多样性有着更丰富的风味，同时也因致病致腐菌的存在而具有一定的安全风险。

杨芳[19]对6种自制酵素进行了优势细菌菌群分布研究，结果表明优势细菌群属于3个属5个种，包括乳酸菌属的一株新型LAB、耐酸乳杆菌和开菲尔乳杆菌；醋杆菌属的巴氏醋杆菌；拟杆菌属的多形拟杆菌。齐天翊[20]对自制的两种酵素进行高通量测序，结果显示酵素样品均中以乳酸杆菌（Lactobacillus）、魏斯氏菌属（Weisseria）、片球菌属（Pediococcus）、明串珠菌属（Leuconostoc）为优势菌群。晏殊[21]对自然发酵六个月的水果酵素中微生物进行分离鉴定，发现自然发酵酵素以非酿酒酵母和醋酸菌为主要优势菌，且具有耐高渗透压的特性。陈英[22]等对植物酵素发酵过程中微生物菌群进行动态监测，发现在植物酵素的自然发酵过程中广泛存在LAB、酵母菌及醋酸菌，从药食同源原料发酵液中驯化得到的独特菌种在发酵的过程中此消彼长，互利共生。土耳其传统非酒精饮料Shalgam juice的菌群主要由LAB组成，占总菌数的89.63%，其次是白串珠菌属（Leuconostoc）和片球菌属（Pediococcus），分别占9.63%和0.74%，另一种土耳其传统非酒精饮料Boza的菌群主要是乳酸菌属和酵母菌属[23]。因此，食用酵素中的微生物主要以LAB、酵母菌、醋酸菌为主。

2.2 工业化生产食用酵素发酵剂

传统发酵工艺存在发酵时间长，发酵产品在发酵过程中易腐烂变质、产生毒素等问题。针对上述问题，近年来食品界学者将目光投向筛选新型益生菌，并将益生菌引入到酵素食品加工中，以提高食用酵素品质以及发酵过程中的可控性，适应工业化生产。基于自然发酵食用酵素中最普遍的菌种为LAB、酵母菌、醋酸菌，食用酵素发酵剂仍然主要以这三种菌种为基础进行单配比或多配比，表2为十大品牌酵素所使用发酵剂的菌种，其中利用微生物发酵剂的占大多数。徐婧君[24]等筛选得到一株具有优良降血脂能力的植物乳杆菌CGMCC8198，将其用于果蔬汁发酵。LAB有一种独特的酶组合，可以代谢植物基质中的各种化合物[25]。张静雯[26]以米曲霉、酵母菌、嗜热链球菌和保加利亚乳杆菌为出发菌株，针对混合菌种发酵对苹果酵素感官评价的影响确定米曲霉的接种量1.5%、酵母菌的接种量1.0%、嗜热链球菌的接种量1.0%、保加利亚乳杆菌的接种量1.0%时感官评价最高，并且淀粉酶、蛋白酶、纤维素酶较未添加菌种组分别提高了50%、85.71%、54.19%。Hwang[27]等用从泡菜中分离的肠系膜明串珠菌KCCM 12010P发酵水培人参的根和芽，与未发酵样品（对照组）相比，肠系膜明串珠菌KCCM 12010P发酵的水培人参显示出抗氧化，抗炎和抗脂肪形成作用也增强。Filannino等[28]解释了在胡萝卜汁中培养的植物乳杆菌会激活有益的途径来感知环境，并采取替代性调节。

表2 十大品牌酵素的发酵剂微生物菌种[1]Table 2 Microorganism strains of the top ten edible ferment extract[1]

3 食用酵素的功能特性

食用酵素的主要原料果蔬、食用菌、谷物等是水溶性维生素B、水溶性维生素C、维生素A原、矿物质、植物甾醇、食用纤维、植物素的来源[29]，一些药食两用的植物如人参、当归、黄芪、山药、枸杞含丰富的类黄酮、皂苷、三萜、多糖、肽类、熊果酸、多酚等功能性成分，多食用果蔬可以预防慢性疾病如高血压、冠心病，降低中风的风险[18]。另有小部分食用酵素添加动物原料如阿胶、鱼蛋白等作为辅料，该类原料含丰富的骨胶原、氨基酸、膳食蛋白，综合各类酵素原材料自带的营养成分以及发酵过程中所产生的功能性营养物质，可以提高原材料的保健功效。食用酵素中所含的有益微生物能起到调节肠道微生态的作用，某些食用酵素在发酵过程中添加的益生元如低聚果糖、大豆低聚糖、菊粉等，也能提高肠道益生菌活性起到调节肠道健康的作用。

3.1 抗氧化

食用酵素含SOD、多酚、维生素等多种可消除活性氧和自由基的物质。自由基在生物体内普遍存在，对人体有害的氧化物质主要有超氧化物自由基、羟基自由基、过氧化氢等[30]。过量自由基易引起氧化应激，氧化应激的阻止也许是潜在治疗老化以及老化相关疾病的一种治疗策略[31]，这些自由基可以通过外界摄取的抗氧化物质来清除。Bae等[32]研究大英菊发酵提取物的的抗氧化作用后表明，发酵后的大英菊提取物1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）自由基清除能力、2,2'-联氮-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸（ABTS）自由基清除能力和超氧阴离子清除能力分 别 提 高 到92.65%、694.25 μmolTrolox/mL和86.38%。蒋增良等[33]研究表明树莓酵素、蓝莓酵素和葡萄酵素超氧阴离子清除能力发酵前后分别升高15.9%、5.7%和12.8%，对羟基自由基的清除能力分别提高12.4%、2.4%和7.0%，对自由基清除能力分别提高17.8%、16.2%和17.2%，并得出3种酵素的抗氧化性与酵素内的多酚含量有浓度相关性的结论。抗氧化活性在一种大米发酵的传印度饮料Haria中同样可见，Ghosh等[34]研究发现Haria对DPPH自由基表现出较高的清除活性，在发酵第4 d时DPPH自由基清除率达82.54%。Li等[35]研究米糠、海藻、猕猴桃等制作而成的微生物酵素EM-YU发现其具有很高的抗氧化、抗菌性、酪氨酸酶抑制活性和病原菌生物膜抑制活性，1.8%EMYU的抗氧化活性与0.01 mg/mL维生素C溶液相当。王辉等[36]也发现在青梅酵素体积浓度为0.25%时，总抗氧化性与100 μg/mL维生素C溶液相当。

3.2 减轻肥胖症状及相关疾病

食用酵素中富含氨基酸、维生素、低聚糖、有机酸和植物性膳食纤维等这些能维持肠内微生物平衡与润肠通便的物质。因此，酵素有助于胃肠对食物的消化、分解、吸收，继而降低血液中的脂肪和糖，起到降血脂和降血糖的功效。郭爽[37]通过建立大鼠减肥模型，发现敖东酵素可以有效抑制大鼠体重增长和脂肪的积累，具有减肥的功效。Just等[38]的研究表明，糙米酵素有助于防止与肥胖相关的血管并发症，有开发成营养药物的可能。Candiracci等[39]的研究也表明服用糙米酵素的实验小鼠腹部和附睾脂肪组织中脂肪细胞变小，该酵素还具有改善肥胖相关炎症反应的功效。Nam等[40]研究表明，摄入发酵大豆提取物可以显著降低空腹血糖和血红蛋白A1c水平，同时保持更高的胰岛素水。这与Lim等[41]的研究有相似结论，表明酵素食品对非胰岛素依赖型糖尿病小鼠模型具有抗糖尿病作用。Pyo等[42]发现口服Monascus发酵大豆提取物显著降低高血脂老鼠的血清总胆固醇、甘油三酯、高密度脂蛋白胆固醇和低密度脂蛋白胆固醇水平，说明其有降血脂的效果。

3.3 抑菌消炎

食用酵素中含有丰富的有机酸，其中主要发挥抑菌作用的是乙酸。Kantachote等[43]检测了19种家庭自制发酵植物饮料的抑菌活性，发现发酵植物饮料对蜡样芽胞杆菌（Bacillus cereus）、大肠杆菌（Escherichia coli）、金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、沙门氏菌（Salmonella）、志贺氏杆菌（Shigella）、铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）和副溶血霍乱弧菌（Vibrio cholerae parahaemolyticus）的抑制性与饮料使用量成正比。同时也指出发酵植物饮料原料中所含的醋酸、乳酸、乙醇、甲醇和乙醛量与该种饮料的抑菌性成正比，得出发酵植物饮料的抗菌活性主要归因于他们所含有机酸的总酸度和一些来源于植物本身的生物活性物质的结论。Ayed等[44]也将发酵康普茶对所有被测细菌都显示出抗菌活性归因于发酵过程中乙酸的产生。Han等[45]给大鼠足底注射脂多糖（LPS）诱导大鼠患内毒素性葡萄膜炎，并立即给其口服发酵苦参根（FSE）和非发酵苦参根（NFSE），从核因子-kappa B（NF-κB）的活性调节和白细胞介素-1β（IL-1β）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、诱导型一氧化氮合酶（iNOS）、细胞间粘附分子（ICAM）-1和环氧合酶-2（COX-2）的表达来研究FSE和NFSE的抗炎作用。结果显示FSE可显著抑制LPS诱导的IL-1β和TNF-α的生成，抑制iNOS、ICAM-1和COX-2的表达以及抑制LPS诱导的NF-κB激活。

3.4 解酒护肝

食用酵素天然的多酶、多因子体系可起到解酒、预防醉酒等作用。醉酒和酒精中毒是我国的公共健康问题之一，因此解酒药物和食物的研发有迫切的社会需求及良好的经济预期。高仕偲等[46]针对中国普遍的醉酒和酒精中毒现象研发了一种解酒酵素。转氨酶作为人体代谢过程中必不可少的酶，其生化指标的变化也是肝脏损伤程度的一个主要指示标准。Bae等[32]研究大英菊发酵提取物的保肝作用发现该发酵提取物可使乙醇损伤HepG2细胞的丙氨酸转氨酶（ALT）活性从117.2 U/mL降低到61.7 U/mL。李凡[47]制备了一种滨海白首乌酵素，其上清液和胞内提取物对乙醇脱氢酶（ADH）和乙醛脱氢酶有较强的激活作用，进行小鼠体内解酒实验结果表明滨海白首乌酵素可以明显延长小鼠的醉酒潜伏时间，缩短醉酒持续时间，并可通过提高ADH活力降低血液中的乙醇含量以及抑制饮酒后血清中谷草转氨酶和谷丙转氨酶活力的升高，对酪氨酸酶也具有一定的激活作用。杨志鹏等[48]分离出一株具有高产谷胱甘肽和高效降胆固醇能力的鼠李糖乳杆菌217-8，用其试制护肝解酒酵素后发现，该酵素中与加速酒精代谢及保护肝脏相关的指标较未发酵前相比均有所上升。Park等[49]将添加乙醇及发酵枳实酵素（FHDE）、只添加发酵枳实酵素、只添加乙醇的饲料对照喂养小鼠29 d，发现FHDE治疗组的甘油三酯、低密度脂蛋白、天冬氨酸转氨酶和ALT活性均显著降低（P<0.05），上调与乙醇脱氢（Adh1和Aldh2）、抗氧化活性（SOD和过氧化氢酶）和脂肪酸氧化（过氧化物酶体增殖物激活受体α和过氧化物酶体增殖物激活受体γ共激活因子1）相关酶基因的表达，指出该酵素提取物通过增强抗氧化性、脂肪酸氧化能力和减少脂肪生成来防止乙醇诱导的肝损伤。

3.5 其他作用

食用酵素与癌症的发病率也有一定关联，Lee等[50]发现1 mg/mL短期大豆发酵提取物显示出很强的抑制MCF7（零纤维肉瘤，人类，KCLB 10121）和HT1080（乳房腺癌，人类，KCLB 30022）生长的作用，抑制率分别为58%和64%。心血管疾病严重威胁人类健康，有研究表明经植物乳杆菌发酵的蓝莓酵素具有抗高血压的功效，并且可降低患心脑血管疾病的风险[3]。López等[51]研究发现大鼠服用发酵柑橘饮料可以增加体内谷胱甘肽、尿酸、抗氧化酶活性、胆红素，降低氧化性低密度脂蛋白，维持体内IL-6和C反应蛋白水平，以上研究充分表明发酵柑橘饮料预防心脑血管疾病功效比柑橘更好。李宁等[52]将20例同种异体原位肝移植临床病例分为口服微生物酵素组与对照组，分别进行酵素服用和正常饮食，发现微生物酵素服用组在肠道菌群失调、消化道功能恢复等方面均明显优于对照组。

4 食用酵素行业存在的问题

食用酵素行业在我国起步较晚，国民的酵素保健意识还较弱，仅处于认知阶段，使得酵素产品在中国并没有得到很好的市场推广，市场潜力有待进一步挖掘。目前工厂制作食用酵素还存在以下几方面的问题：（a）菌种安全性：自然发酵过程中存在菌种是否有害不确定性，最常见的菌种安全性问题是混合微生物自然发酵可能会产生混合醇，其中甲醇易引起中毒[53]。食用酵素在发酵通气时也易污染杂菌致使产品质量较难控制，影响产品利用率和可食用性；（b）生产后加工工艺：产品的后加工存在一定问题，主要体现在后加工杀菌工艺不完善，导致市售酵素大多存在益生菌缺乏、生物酶活性弱、风味不佳等缺点，杀菌后质量不稳定；（c）市场监管：目前我国酵素市场缺乏针对性管控文件，相应的工艺技术、品质评估标准和管理法规还不完善，使得国内酵素市场产品良莠不齐，真正拥有QS认证和具备保健批文的产品很少；（d）自主产权：由于国内生产酵素企业没有掌握自主研发核心技术，大多依靠外来技术支持，使酵素市售价格普遍偏高。

上述实际问题是当前国内酵素行业亟待解决的难题，相应的解决方法也在逐步完备。针对问题（a），业内专业人士研制出代替自然发酵菌种的益生菌发酵剂，开发将杂菌污染降到最低的通气工艺。针对问题（b），研究人员加大对不同生产后杀菌工艺的研究力度以求达到最佳产品品质。针对问题（c），酵素行业工艺技术、法律法规等逐渐在完善，一系列酵素产品标准规范逐渐出台，如中国生物发酵产业协会2016年出台《食用酵素良好生产规范》、2017年6月正式实施《食用植物酵素》团体标准、中国轻工业联合会2018年提出《酵素产品分类导则》。针对问题（d），各大公司及个人申请专利，关于酵素食品生产工艺和工厂生产工艺流水线的专利逐年增多；各高校、科研院所逐步推进食用酵素研究课题，2019年6月“全国酵素研究中心”于华东理工大学生物工程学院成立，旨在为中国酵素产业搭建一个学术交流的平台、研发核心技术。

5 展望

食用酵素是一种富含有益人体健康成分的功能性发酵食品，具有抗氧化抗衰老、减轻肥胖症状及相关疾病、抑菌消炎、解酒护肝、预防癌症、提高免疫力等功效，符合现代人追求健康和养生长寿的保健需求。新鲜果蔬、食用菌等资源庞大但保质期短，通过益生菌发酵制成酵素能延长食物保质期，降低食品资源浪费率。同时，食用酵素中残余的果肉具有抗菌消炎、抗衰老美白、去角质等功效，可被运用于化妆品行业；后处理残渣可用做畜牧业饲料、农作物酵素肥。然而，酵素发酵是一个复杂的过程，尽管酵素产品中微生物的发酵代谢产物及某些具体功效成分已得到验证，但有关酵素发酵代谢的机理仍然存在一些模糊点和猜测性结论。食用酵素发酵过程中潜在的微生物菌群及其代谢物的构效关系仍需深入研究。随着酵素的产业化工艺技术、品质评估标准和管理法规的完善，将有利于酵素产品的质量控制和品质提升，具有广阔的市场前景。