复合菌制剂设计及其在食品发酵中应用的研究进展

王艺欣，张 健 ，井月欣，王共明，刘 芳，田秀慧，刘 奎，刘海超，韩 爽，钟静诗

（1.上海海洋大学食品学院，上海 201306；2.山东省海洋资源与环境研究院，山东烟台 264006）

发酵是一种古老的食品加工保存技术[1]。发酵过程中，不同微生物之间复杂的相互作用将原料中的碳水化合物、脂肪和蛋白质等大分子物质降解成更容易吸收的小分子活性物质[2]，从而提高营养利用率，改善食品的质地、适口性、感官特性和消化率，延长产品的保质期[3]。一些发酵产物还能够调节人体的免疫系统，起到降低某些疾病风险的作用[4]。自然发酵过程中环境的变化和微生物种类的波动，可能会影响发酵食品的质量[5]和安全性[6]。因此，选择具有理想功能特性，且通过鉴定确认毒理学安全性的，能够提供标准风味和期望代谢活性的菌株[7]作为食品发酵工业发酵剂，是保障发酵食品品质和安全性的必要条件。

目前，在环境和经济等因素的影响下，消费者对健康的、具有地方特色的传统发酵产品的需求促使传统发酵与现代生物技术的融合发展。相对于单一菌制剂，复合菌制剂能够模拟自然发酵中多种微生物的协同作用，在提高生产效率的同时，能够更好的还原传统发酵食品的风味特性[8]，已成为当下发酵工艺研究的热点之一。为此，本文从复合菌制剂的研究进展、制备方法、设计优化以及其在传统的发酵食品和发酵水产品中的应用等方面进行了综述。

1 复合菌制剂概述

1.1 现代工业发酵剂

现代食品发酵工业中，将传统发酵食品中的优势菌株分离出来做发酵剂，以达到缩短发酵时间，实现大规模工业生产[9]，提高产品质量和稳定性的目的[10]。目前常用作食品发酵剂的菌株如表1所示。

传统发酵食品发酵过程中，发酵环境等[22]因素的变化会影响产品的品质。如酱油酿造过程中按照“春曲、夏酱、秋油”的时序实现发酵过程中菌种的生长代谢平衡。为了改善自然发酵的不稳定性，实现发酵产品的工业化大规模生产，发酵剂在现代工业发酵中得到了广泛的应用。与自然发酵相比，外接发酵剂有以下优势[23−24]：

a. 可提高发酵体系中有益菌株的浓度，发酵过程中酸含量增加，降低或抑制腐败致病菌对发酵产品安全性的影响；

b. 使得发酵过程人为可控，不受环境等外界因素的影响。根据不同需求添加发酵剂，缩短发酵周期，降低发酵成本，提高发酵产量；

c. 可以降低发酵过程中产生的有害物质的含量，更好地保障发酵食品的安全性。

现代工业发酵剂一般所用菌种单一[25]，发酵过程中产生的生化反应相对简单，不能够满足生化过程复杂、成分多样的发酵食品生产。在纯种发酵思维的影响下，近年来发酵工业上所用到的混菌发酵剂不能够很好的发挥菌种间的协同增效作用，且难以控制发酵过程中菌种的生长代谢平衡[26]，往往会造成产品多样性和地域性风味的缺失。目前商业化的发酵剂所面临的挑战之一，即如何能够在大规模生产中提高产品稳定性，且能改善工业发酵导致的风味单一化的问题。

1.2 复合菌制剂及其特点

复合菌制剂是为获得更加全面的发酵效果将两种或两种以上的有特定功能的菌株混合制成的微生物制剂[27]。用于配制复合菌制剂的微生物，都是经过鉴定具有一定的安全性，能够表现出期望代谢活性并有利于发酵过程的菌株。菌种复合后有利于保存自然发酵产品风味多样性、提高产品的产量[28]。与纯菌发酵剂相比，多菌复合构成一个相对完整的生物体系，以微生物之间的相互作用为桥梁，维持良好的发酵环境，得到具有期望特性的产品[29]。

自20世纪80年代，有学者通过研究菌种之间的相互作用提出，根据各菌种的优势组合不同活菌制剂的设想[30]。此后科研人员在复合菌制剂的研制和应用方面进行了大量研究。

目前，国内外已有大量关于复合菌制剂在发酵食品方面的研究。学者们普遍认为复合菌制剂发酵食品能够充分利用原料，提高产品的营养价值、改善产品的风味品质[31]。如纳豆芽孢杆菌与乳酸菌复合发酵能够提高全豆豆乳中的粗蛋白、粗脂肪和一些风味物质的含量[32]；多菌复合制曲发酵高盐稀态酱油通过改善酱油发酵过程中的酶系，改善酱油的风味，大大提高了酱油的品质[33]；韩德权等[34]认为多菌复合发酵剂发酵蔬菜的感官品质和营养价值高出市售一倍不止。复合菌制剂发酵有提高产品的稳定性和安全性，延长货架期的作用。Zhao等[35]发现复合菌制剂发酵过程中羊肉香肠的pH、水分活度（Aw）迅速下降，抑制腐败菌和致病菌的生长。Saithong等[36]通过对比自然发酵与复合菌制剂发酵Plaa-som发现，复合菌发酵产品的酸度远高于自然发酵。此外，复合菌制剂发酵可以节约工业生产成本，以复合菌制剂发酵泡菜为例，不仅可以缩短发酵周期，还提高了发酵过程的稳定性，减少用盐量，从源头减少泡菜高盐废水的排放量[37]。

2 复合菌制剂设计

2.1 设计原则

复合菌制剂的设计，首先要了解自然发酵食品中微生物体系之间的相互作用。明确发酵食品中微生物之间的相互作用关系，有利于开发出具有相应特色的复合菌制剂，从而生产出质量稳定、品质优良的发酵食品。复合菌制剂的设计应坚持以下原则，一是选择混合菌种的种类应遵循少而精的原则[27]；二是复合菌制剂的设计一般遵循互利共生和偏利共生等协同相互作用，即[38−39]：

a. 发酵过程中，不同微生物间均能从对方受益，相互促进对方的生长代谢；

b. 发酵过程中，一种微生物促进另一种微生物的生长代谢的同时，本身不受影响。

利用微生物之间的协同作用，在优势效应的影响下，发挥各菌种自身的优势，从而提高复合菌制剂的综合功能。

2.2 复合菌制剂制备

复合菌制剂的制备过程如图1[40]。

图1 工业复合菌制剂的制备流程Fig.1 Preparation process of industrial compound bacteria preparation

2.2.1 剂型的选择 一般发酵剂按照物理状态可分为液态和粉剂两种。液态发酵剂是将分离纯化的菌株活化后，扩大培养制成的以液体状态保存的发酵剂。粉末状发酵剂是将富集培养后的菌株离心，制备菌悬液，再通过真空冷冻干燥或者喷雾干燥等方法制备而成的。复合菌制剂一般以粉剂为主[41]。这是因为与液态发酵剂相比，粉剂体积小，更易保存，不易受到杂菌的污染，用于生产时可以直接投入，不需活化，缩短了生产周期。

2.2.2 菌种的选择 微生物的群体种类和之间的相互作用，影响着发酵食品的质量和安全性。筛选具有优良性状的发酵优势菌种，研究各菌种间互生和拮抗特性，对制备科学合理的发酵剂菌种搭配方案很重要。

复合菌制剂的菌种选择方法通常可分为两种。一是利用具有地方特色的传统发酵产品中分离筛选出来的并具有一定代表性的优势菌株进行复配。传统发酵产品中的优势菌能够更好地适应生态环境和加工条件，更有效地开发和控制产品[42]。此外，其发酵过程中释放的酶，有助于生产具有地域特色的发酵食品。通过使用影响发酵食品风味质地的具有本土特色的复合菌制剂，不仅能够改善发酵产品口感单一的问题，还可以开发出具有地区典型特性的标准化安全食品[43]。石建喜等[44]将从传统发酵鲢鱼肉中分离出的植物乳杆菌、酿酒酵母和木糖葡萄球菌制成复合发酵剂发酵鲢鱼肉发现，不仅可以抑制发酵过程中的腐败菌和致病菌的生长，还能够产生积极的特色发酵风味。

另一种方法则是将已知特点的有益菌株复配应用于食品的发酵过程中，以达到增加风味物质、延长保质期或者减少有害物质生成等商业目的。例如，阮一凡等[45]将植物乳杆菌和酿酒酵母复合应用开发发酵鸭腿产品，用来抑制产品脂肪的氧化、感官的劣变和分解发酵过程中产生的不良生物胺。Palavecino等[46]将清酒乳杆菌分别和小牛葡萄球菌与木糖葡萄球菌复合发酵香肠用于降低发酵过程产生的硫代巴比妥酸（thiobarbituric acid reactive substances，TBARS）。

2.2.3 现代生物学技术在菌种选择中的应用 通过现代生物学技术手段，认识发酵过程中微生物的形态和特性，研究微生物属性及其在发酵过程中潜在的代谢能力[47]，揭示了发酵微生物与发酵食品的风味形成机制，为不同功能的复合菌制剂的复配提供了十分有力的保障。基因组学为复合菌制剂菌种的选择过程提供了理论依据。近年来，现代分子生物学的飞速发展，基因分析检测技术被应用于发酵食品微生物群落的研究中，如表2所示。

表2 常用菌种检测技术Table 2 Common bacteria detection technology

2.3 复合菌制剂设计优化方法

在发酵工艺中，影响发酵产品品质的因素有很多，如菌种接种量，发酵条件和发酵培养基的成分等。优化发酵工艺条件对提高发酵产品质量和数量起着重要作用。复合菌制剂的制备过程中对其制备技术参数的优化和发酵工艺的优化同样重要。李银娜[51]通过单因素法对嗜酸乳杆菌复合菌种发酵稀奶油生产工艺进行优化，得出当发酵温度为39 ℃，复合菌种配比为1:1:1:1，接种量为7%时，发酵稀奶油中活菌数最高且产品酸味柔和，组织状态细腻平滑，无乳清析出，凝乳时间缩短。胡强等[52]利用正交设计试验对动物源益生菌和植物源益生菌复合菌剂发酵调味笋工艺影响因素进行探讨及优化，提高了发酵产品中肠道益生菌、花青素及膳食纤维等有益因子含量，得到一条良好的新型复合菌发酵调味笋生产工艺流程。单因素法和正交试验应用于发酵产品工艺优化，极大程度地降低了工作量，提高筛选效率。但是两者都不能得出最适因素和响应值之间的回归方程，即无法找到整个区域的最适因素组合和最优响应值。

随着计算机技术的快速发展，利用计算机统计软件辅助优化筛选过程的研究已经成为现实。科学家们在单因素实验和正交试验的基础上构建高效实验设计，将SPSS、SAS、STATISTIC等计算机统计软件引用到设计优化实验的结果分析中，准确、高效地得出优化结论。常用的优化方法有Plackett-Burman设计、最陡爬坡试验、响应面试验等。邢慧雅[53]基于模糊数学统计的基础上，利用响应面优化得出当接种量2.8%，发酵时间10 h，菌种的比例为2:1时，藜麦浓浆的感官评分最高。卢芸等[54]通过利用单因素法和Plackett-Burman设计等筛选出显著影响扇贝边酱发酵的因素，通过响应面优化分析得出最优化的扇贝边酱发酵工艺。

3 复合菌制剂在食品加工中的应用

复合菌制剂在食品加工中常用于发酵调味制品、谷类制品、饮料和酒类、肉制品、蔬菜等。微生物发酵能够利用由各种酶类降解蛋白质、脂肪、碳水化合物等大分子物质所形成的氨基酸、脂肪酸、单糖等小分子代谢产物进行初级代谢和次级代谢，形成多种挥发性代谢产物[55]。因此在食品的发酵过程中微生物的多样性对提升产品品质、改善产品风味有着非常重要的实际意义。

3.1 在酒饮料发酵中的应用

随着人们对大曲中微生物的深入研究和现代生物技术的不断发展，人工接种纯菌强化大曲是，最常用的提高原料利用率、开发新产品的一种方法。但这种方法对传统的发酵生产大曲的生物稳定性与协调性有影响。针对这一问题，陈雪玲等[56]提出用复合菌制剂制备强化大曲以减少人工接种对大曲稳定性和协调性的影响。实验证明利用复合菌剂强化大曲在提高大曲的感官等级的同时其糖化力、液化力、发酵力、酯化力等也显著的提高。研究表明当酿酒酵母（S.cerevisiae）与非酿酒酵母（Non-Saccharomyces）复合发酵，会使得发酵酒饮料的香味成分多样化，突出其品种特色和地域特征[57]。酿酒酵母与美极梅奇酵母（Metschnikowia pulcherrima）发酵后樱桃酒中的高级醇、酯类、萜类物质含量增加能够改善酒体的风味[58]。此外，多菌复合能够改善酒制品的口感和色泽。如东方伊萨酵母与酿酒酵母复合能够降低产品中的酵母味和涩味，改善产品的口感[59]；酿酒酵母与地衣芽孢杆菌（B. licheniformis）复合发酵酱香白酒，使得白酒的酱香味更加的醇厚[60]；朱娟娟等[61]表示不同酵母复合发酵剂发酵红葡萄酒，酒体的颜色更加倾向红葡萄酒陈酿。一些非酿酒酵母[62]和乳酸菌[63]等添加到复合菌制剂中，能够降低酒精度数。

3.2 在肉制品发酵中的应用

发酵肉制品是指原料肉在自然或者人为控制的条件下，经过微生物的特定作用，提高肉制品酸性，形成风味质地独特、储存时间久的新型肉制品[64]。商业发酵剂发酵肉制品，虽能够缩短生产周期，但是在风味和质感方面略显单一。有学者研究发现，复合菌制剂能够增加肉制品中醛、酮类物质[65]，改善肉制品的嫩度[66]。由此可见，复合菌制剂发酵能够改善肉制品的风味品质。

复合发酵剂还能够抑制有害微生物的增殖和有毒成分的产生。实验证明，乳酸球菌和清酒乳杆菌能够明显抑制肉制品中单核细胞增生李斯特菌等肉制品中的腐败菌和致病微生物的生长，并能够降低肉制品发酵过程中生物胺的含量[67−68]。Sun等[69]在哈尔滨干肠中添加清酒乳杆菌、戊糖乳杆菌及弯曲乳杆菌复合发酵，发酵结束后产品的亚硝酸盐含量显著下降。卢涵等[13]利用植物乳杆菌和葡萄球菌接种猪肉发酵制作香肠，测定整个过程中蛋白质和脂肪的氧化情况，并与自然发酵过程对比发现，使用复合发酵剂制香肠的TBARS值显著低于自然发酵，这说明复合发酵剂发酵肉制品有一定的抑制脂质过氧化的作用。近年来，研究发现一些微生物（如：肠杆菌、库特氏菌属等）可以有效地改善肉制品的色泽，在此基础上，樊康[70]将乳酸菌希腊魏斯菌与植物乳杆菌复合发酵肉制品发现，肉制品色泽鲜艳，可代替亚硝酸盐对发酵肉制品进行护色。

3.3 在谷类制品发酵中的应用

发酵谷类制品种类多样，常见的有面包、馒头、米糕等。我国北方多以面食为主，馒头是最常见的传统发酵食品之一。为了改善当前商品化加工馒头风味同化的问题。有学者对发酵酸面团中的微生物组成进行了分析，发现发酵过程中起主要是酵母菌和乳酸菌[71]。只有在多种酵母菌和乳酸菌的共同作用下进行发酵，才能够赋予酸面团发酵制品独特的质地和风味[72]。刘晨[73]参考西方国家对于酸面团风味的研究，对复合菌制剂发酵和活性干酵母发酵的馒头进行分析得出，复合菌制剂馒头中风味物质高于活性干酵母馒头。复合菌制剂发酵能够有效地延缓淀粉的老化、减少抗营养因子并延长保质期，使得成品质地细腻且香甜可口、具有较高的咀嚼性及凝聚性[74]，更符合消费者对食品营养保健、安全健康的要求。比如，利用复合菌制剂发酵的苦荞麸皮馒头综合品质优于单一酵母发酵的馒头[75]；酵母菌复合菌制剂能够有效的改善米粉的口感和香味[76]。此外，吴寒等[77]利用植物乳杆菌与米根霉复合发酵燕麦发现，必需氨基酸含量显著增加。因此，复合菌制剂发酵有一定的提高谷类制品营养价值的作用。

3.4 在水产品加工中的应用

发酵水产品是一类风味独特的发酵食品[78]。数千年以来，世界各地基于不同的饮食文化发展出了种类众多的具有不同风味、口感、食用方式等特点的水产品。

3.4.1 在水产调味料中的应用 水产调味料（如耗油、虾酱、鱼露等）因为其营养丰富、风味独特受到人们的青睐[79]。以一些水产品的下脚料为主要原料[80]，利用复合菌制剂发酵可制成富含氨基酸氮的天然调味料[81]，不仅能够提高产品的质量和稳定性，还能够进一步提高水产品的利用率。研究人员在单一菌种发酵的基础之上，外接复合菌制剂发酵虾酱发现，产品中的有害物质、盐含量减少，呈味氨基酸含量增加且生成速度加快[82]。刘烨[80]将四种单一菌种发酵制成的海带酱油与多菌种混合发酵的海带酱油进行对比发现，多菌种混合发酵产生的酱油氨基态氮含量远远高于单一菌种发酵，并且酱油颜色鲜艳，有光泽，并且带有独特的酱香味，甜咸适口，味道鲜美，氨基酸态氮的含量高达2.91%。这说明，复合菌制剂发酵水产调味品有一定增加产品风味色泽的作用。

3.4.2 在发酵鱼制品中的应用 鱼肉经过微生物发酵之后，蛋白质和脂肪被分解为氨基酸和脂肪酸，并且氨基酸和脂肪酸等小分子物质在降解的过程中能够形成发酵鱼制品所特有的风味成分。复合菌制剂发酵鱼肉制品能够有效缩短发酵时间、提高产品的营养价值和品质风味。目前，芽孢杆菌和葡萄球菌已经被用作发酵鱼产品的复合菌制剂[83]；植物乳杆菌、木糖戊球菌和酿酒酵母也被制成复合菌制剂用于提高酸鱼的风味[84]。于沛沛等[85]利用复合菌制剂发酵鲢鱼结果表明，产品的组胺和酪胺含量下降，远低于安全标准。由此可知，复合菌制剂能够降解发酵过程中的有害物质，提高发酵产品的安全性。

在鱼露的生产过程中，Gao等[86]提出，利用产蛋白酶的嗜盐微生物做发酵剂可以有效地加速鱼露的发酵。Akolkal等[87]从不同的发酵鱼制品中分离得三株具有产蛋白酶活性的嗜盐菌，将其制成复合菌制剂进行发酵，与对照组对比发现，鱼露的发酵时间明显缩短。Zheng[88]和Lee[89]等分别利用psychrobacter sp-1和多黏芽孢杆菌做发酵剂发现sp-1可以用于改善鱼露的质量，多黏芽孢杆菌减少了鱼类发酵过程中组胺和生物胺。

4 展望

随着生活水平的提高，食品安全问题日益受到人们的关注，消费者对发酵食品的安全性和营养价值的要求越来越高，纯菌发酵食品逐渐难以满足人们的需求。复合菌制剂的配制及其对发酵食品的影响已成为当下发酵食品的研究热点之一。目前，国内大型发酵企业在不断的探索开发存活率高、稳定性强、发酵性能好、能够实现地域性发酵食品独特口感的新型发酵剂。近年来，功能性食品不断地受到市场的追捧，不少研究者对益生菌复合发酵功能性食品进行了初步的研究，比如Jhan等[90]将红豆在保加利亚乳杆菌和纳豆芽孢杆菌共同发酵下，抗氧化物质的浓度明显提高；李燕[91]以乳酸菌、红曲霉和黑曲霉共同发酵果醋发现，产生抑制胆固醇合成Monacolin K的物质。相关研究为其工业化生产提供了数据支撑，也为复合菌制剂中菌种的选择和配置提供了理论依据。

目前水产品主要以冰鲜冷冻销售为主，附加值相对较低，不利于商业价值的提升。水产品经过发酵加工不仅可以除去特有的腥味，还可以获得独特的风味物质及功能物质，有助于进一步提高产品的安全性及商业附加值。复合菌制剂应用于水产品发酵中，必将进一步推动发酵水产品产业的发展。