调控类风湿关节炎PBMC中miR-142-3p的表达对ADAM17表达及成纤维样滑膜细胞活性的影响

吴 洁，马 玲，付冬冬，杨学华，吕书龙，范文强，王培山

1)新乡市中心医院风湿免疫科 河南新乡 453000 2)新乡市第二人民医院肾病风湿科 河南新乡 453000 3)新乡市中医院风湿科 河南新乡 453000 4)新乡市中心医院麻醉手术部 河南新乡 453000

类风湿关节炎(rheumatoid arthritis,RA)是一种自身免疫性疾病，病理特征表现为关节滑膜细胞增生、新生血管形成血管翳、炎性细胞浸润以及软骨和骨结构破坏，导致患者关节功能丧失和畸形[1-2]。在RA发病过程中，成纤维样滑膜细胞(fibroblast-like synovial cells,FLS)异常活化、“肿瘤样”增生，是导致滑膜组织增生和关节破坏的主要效应细胞[3-4]。因此， FLS增殖和活化方面的研究对于控制RA病情具有十分重要的意义。研究[5-7]表明，微小RNA(microRNA,miRNA/miR)与RA的发生发展关系密切。在RA患者外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMC)中，miR-142-3p表达水平升高，且与类风湿因子浓度呈正相关，影响RA的发生发展[8]。本研究通过生物信息学预测发现解聚素金属蛋白酶17(adisintegrin and metalloproteinase 17,ADAM17)可能是miR-142-3p的靶基因。ADAM17也称肿瘤坏死因子α转换酶，通过将不同的跨膜蛋白及其受体裂解为可溶性形式来调控大量基因的表达，参与细胞增殖、凋亡、炎症等过程[9-10]。本研究拟观察RA-PBMC中miR-142-3p和ADAM17的表达变化，观察调控RA-PBMC中ADAM17和miR-142-3p的表达对FLS增殖及凋亡的影响，旨在探索miR-142-3p在RA发病进程的作用机制，为RA的治疗提供新思路。

1 材料与方法

1.1主要试剂和仪器RPMI 1640培养基、DMEM培养基、胎牛血清购自美国Hyclone公司，miR-142-3p模拟物/抑制物及其阴性对照(NC)、pcDNA-ADAM17、荧光素酶报告载体购自上海吉玛生物科技有限公司，Trizol试剂、胰蛋白酶购自上海碧云天生物技术有限公司，反转录试剂盒、实时荧光定量PCR试剂盒购自日本TaKaRa公司，噻唑蓝(MTT)、二甲基亚砜(DMSO)购自美国Sigma公司，Lipofectamine2000购自美国赛默飞世尔有限公司，RIPA裂解液购自北京Solarbio公司，β肌动蛋白(β-actin)、ADAM17抗体购自美国Cellular Signaling Technology公司，辣根过氧化物酶标记的二抗购自武汉博士德生物工程有限公司。ABI 7500荧光定量PCR仪购自美国ABI公司，倒置显微镜购自日本Olympus公司，酶标仪购自美国Bio-Rad公司，流式细胞仪购自美国Beckman公司。

1.2细胞来源及培养人正常PBMC、RA-PBMC和RA-FLS购自中科院上海细胞库。正常PBMC、RA-PBMC以含体积分数10%胎牛血清和100 U/mL青链霉素双抗的RPMI 1640培养基，RA-FLS以含体积分数10%胎牛血清的DMEM培养基，在37 ℃、体积分数5%CO2培养箱中培养。显微镜下观察细胞生长状态，密度达80%左右时，使用2.5 g/L胰蛋白酶消化，进行传代培养。

1.3miR-142-3p与ADAM17靶向关系的预测及双荧光素酶报告实验验证运用生物信息学软件TargetScan(http://www.targetscan.org/vert_71/)预测miR-142-3p与ADAM17的靶向关系。由上海吉玛生物科技有限公司合成野生型(WT)和突变型(MUT)ADAM17的3’UTR荧光素酶报告基因载体。利用Lipofectamine2000将miR-142-3p模拟物或其NC与ADAM17-WT或ADAM17-MUT载体共转染入RA-PBMC，48 h后收集细胞，按照双荧光素酶报告实验检测试剂盒说明书操作，测定荧光素酶活性。

1.4正常PBMC和RA-PBMC中miR-142-3p和ADAM17蛋白表达的检测

1.4.1 miR-142-3p 采用实时荧光定量PCR法检测。收集正常PBMC和RA-PBMC，用Trizol试剂提取总RNA，利用反转录试剂盒合成cDNA，以cDNA为模板，根据实时荧光定量PCR试剂盒说明书操作，进行PCR。miR-142-3p正向引物序列为5’-GTCGTATC CAGTGCAGGG-3’，反向引物序列为5’-CGACGTG TAGTGTTTCCTA-3’。以U6为内参，以2-ΔΔCt法计算miR-142-3p相对表达量。实验重复3次。

1.4.2 ADAM17 蛋白 采用 Western blot法检测。收集正常PBMC和RA-PBMC，用RIPA裂解液提取细胞总蛋白，经SDS-PAGE分离，将蛋白转移到PVDF膜，常温下用50 g/L脱脂奶粉封闭1 h，加入1∶1 000稀释的一抗4 ℃孵育过夜，之后TBST洗涤10 min×3次，加入二抗室温孵育1 h，TBST洗涤10 min×3次，化学发光液显色，显影、拍照。以β-actin作为内参，应用Image J软件通过光密度分析法计算蛋白相对表达量。实验重复3次。

1.5抑制RA-PBMC中miR-142-3p表达对RA-FLS增殖和凋亡的影响

1.5.1 实验分组 将RA-PBMC分为两组，利用Lipofectamine2000分别转染miR-142-3p抑制物和抑制物NC。选取处于对数生长期的RA-FLS，按1×105个/mL的密度接种于Transwell小室下室，以20∶1的比例将RA-PBMC接种于上室，小室置于37 ℃、体积分数5% CO2培养箱中孵育48 h。用镊子小心取出小室，收集RA-FLS用于细胞增殖和凋亡检测，收集RA-PBMC用于ADAM17表达的检测。实验重复3次。

1.5.2 RA-FLS增殖的检测 使用胰蛋白酶消化RA-FLS，以1×104个/mL的密度接种于96孔板，培养0、24、48、72 h后，加100 μL的MTT(5 g/L)溶液37 ℃孵育4 h，弃上清液，每孔加入200 μL DMSO，37 ℃摇床孵育10 min，用酶标仪测定细胞在波长490 nm处的吸光度(A)值。每个时间点设置5个复孔。实验重复3次。

1.5.3 RA-FLS凋亡的检测 使用胰蛋白酶消化细胞，将细胞密度调整为1×105个/mL，加入500 μL Annexin V缓冲液，将重悬后的细胞转移至EP管，每管细胞加入5 μL Annexin V-FITC和5 μL PI，充分混合，室温避光条件下孵育30 min，置流式细胞仪检测细胞凋亡率。实验重复3次。

1.6过表达ADAM17和miR-142-3p的RA-PBMC对RA-FLS增殖和凋亡的影响将RA-PBMC分为空白对照组(未转染)、miR-142-3p模拟物组、pcDNA-ADAM17组、miR-142-3p模拟物+pcDNA-ADAM17组，应用Lipofectamine2000转染相应质粒。然后将4组PBMC分别接种于Transwell小室上室，接种RA-FLS于下室，处理方法同1.5.1。收集RA-PBMC用于miR-142-3p、ADAM17表达的检测，收集RA-FLS用于细胞增殖活性(72 h)和凋亡的检测，检测方法同前。实验重复3次。

1.7统计学处理采用SPSS 22.0进行统计分析。荧光素酶活性、正常PBMC和RA-PBMC中miR-142-3p和ADAM17表达水平、miR-142-3p抑制物和抑制物NC组细胞凋亡率的比较采用两独立样本的t检验， miR-142-3p抑制物和抑制物NC组细胞增殖活性的比较采用2×4析因设计的方差分析，空白对照组、miR-142-3p模拟物组、pcDNA-ADAM17组、miR-142-3p模拟物+pcDNA-ADAM17组miR-142-3p、ADAM17表达水平、细胞增殖活性和凋亡率的比较采用2×2析因设计的方差分析，检验水准α=0.05。

2 结果

2.1miR-142-3p与ADAM17靶向关系的验证TargetScan预测结果显示miR-142-3p与ADAM17的3’UTR区域有结合位点(图1)。双荧光素酶报告实验结果显示，miR-142-3p模拟物抑制ADAM17-WT报告基因的荧光素酶活性(P<0.05)，对ADAM17-MUT无显著影响(表1)。

图1 miR-142-3p与ADAM17蛋白靶向关系的预测

表1 双荧光素酶活性检测结果(n=3)

2.2正常PBMC和RA-PBMC中miR-142-3p和ADAM17表达的比较与正常PBMC相比，RA-PBMC中miR-142-3p表达增加，ADAM17蛋白表达下降，见图2、表2。

1～3：正常PBMC；4～6：RA-PBMC

表2 正常PBMC和RA-PBMC中miR-142-3p和ADAM17表达的比较

2.3抑制RA-PBMC中miR-142-3p表达对RA-FLS增殖和凋亡的影响见表3。miR-142-3p抑制物组RA-FLS增殖活性较抑制物NC组增强，同时细胞凋亡率降低。

表3 两组RA-FLS增殖活性和凋亡率的比较

2.4过表达ADAM17和miR-142-3p的RA-PBMC对RA-FLS增殖和凋亡的影响与空白对照组相比，miR-142-3p模拟物组miR-142-3p表达水平升高，ADAM17蛋白表达水平降低(P<0.05)，RA-FLS增殖活性降低，细胞凋亡率升高(P<0.05)；pc-DNA-ADAM17组miR-142-3p表达水平降低，ADAM17蛋白表达水平升高，RA-FLS增殖活性升高，细胞凋亡率降低(P<0.05)。miR-142-3p模拟物与pcDNA-ADAM17的作用相互拮抗。见图3、表4。

1：空白对照组；2：miR-142-3p模拟物组；3：pcDNA-ADAM17组：4：miR-142-3p模拟物+pcDNA-ADAM17

表4 4组RA-PBMC中 ADAM17、miR-142-3p表达及RA-FLS增殖、凋亡率的比较

3 讨论

RA是一种慢性全身性的免疫性疾病，持续性的关节炎症引发软骨和骨骼损伤、残疾，最终导致不可逆的关节破坏和功能丧失，影响患者生活质量，增加死亡率[11]。目前，RA的临床治疗手段包括药物、手术和功能锻炼等[12]，但其发病原因尚不明确。滑膜组织增生是RA的主要特点之一。滑膜细胞包括FLS和巨噬细胞，前者是构成滑膜组织的主要成分。FLS影响滑膜细胞的增殖、凋亡、迁移等[13]，在RA发病过程中扮演着重要角色。

miRNA是一种高度保守的内源性非编码RNA，通过与下游靶mRNA的碱基结合抑制或者直接降解靶mRNA，参与细胞生长、分化、增殖和凋亡等多种生理过程[14-15]。新的证据表明，一些miRNA在RA的发生、发展过程中发挥着重要作用[16-17]。miRNA-192通过下调微囊蛋白1(Caveolin 1,CAV1)抑制RA-FLS增殖，诱导细胞凋亡[18]。miR-125b在RA患者血清和滑膜组织中表达上调，通过激活NF-κB信号通路促进RA炎症反应[19]。本研究中，miR-142-3p在RA-PBMC内表达上调；利用miR-142-3p模拟物/抑制剂转染上调或下调RA-PBMC中miR-142-3p表达量，可显著影响RA-FLS的增殖与凋亡能力；miR-142-3p过表达则抑制RA-FLS增殖，诱导其凋亡；抑制miR-142-3p表达作用则相反。研究结果说明上调RA-PBMC中miR-142-3p表达可能对RA有治疗效果。

ADAM17是普遍存在的跨膜“分子剪刀”，具有水解蛋白、活化配体、释放生物活性因子的功能，被视为抵御伤害和感染的第一道防线[20-21]，在免疫系统、中枢神经系统以及癌症中发挥了重要作用[22]。本实验中，RA-PBMC中ADAM17蛋白表达水平明显下调，说明ADAM17可能参与了RA发展进程。生物信息学预测结合双荧光素酶报告实验结果证实ADAM17是miR-142-3p的靶基因。本研究中我们上调RA-PBMC中miR-142-3p表达，可以明显降低ADAM17表达量，表明miR-142-3p对ADAM17表达起负性调控作用。在RA-PBMC中共转染miR-142-3p模拟物和pcDNA-ADAM17，发现过表达ADAM17可以逆转过表达miR-142-3p的RA-PBMC对RA-FLS的增殖抑制和凋亡诱导作用。

综上所述，miR-142-3p可能通过调控RA-PBMC中ADAM17的表达，抑制RA-FLS增殖，诱导其凋亡，影响RA发生发展。这为深入研究RA的发病机制提供了参考。