miRNA-30a-5p过表达对肾癌细胞株786-0增殖、凋亡的影响

来卫东,戴尊收,赵爱国,胡娜,刘琳琳,顾润国

(1山东医学高等专科学校，山东临沂 276000；2山东医学高等专科学校附属医院)

miRNA-30a-5p过表达对肾癌细胞株786-0增殖、凋亡的影响

来卫东1,戴尊收2,赵爱国1,胡娜1,刘琳琳1,顾润国1

(1山东医学高等专科学校，山东临沂 276000；2山东医学高等专科学校附属医院)

目的观察miRNA-30a-5p过表达对肾癌细胞株786-0增殖、凋亡的影响，并探讨其机制。方法将肾癌细胞株786-0分为模拟物组、抑制物组、未转染组，模拟物组转染miRNA-30a-5p模拟物，抑制物组转染miRNA-30a-5p抑制物，未转染组为正常肾癌细胞株786-0。采用实时荧光定量PCR法检测模拟物组、抑制物组、未转染组肾癌细胞株786-0及正常人肾小管上皮细胞HK-2(正常组)miRNA-30a-5p，CCK-8法观察各组培养24、48、72 h后的细胞增殖能力，流式细胞术观察前三组细胞凋亡情况，Western blotting法检测前三组细胞中异黏蛋白(MTDH)表达。结果正常组、模拟物组、抑制物组、未转染组细胞miRNA-30a-5p mRNA相对表达量分别为1.00±0.00、1.32±0.05、0.32±0.05、0.52±0.06，正常组、模拟物组、抑制物组与未转染组相比，P均<0.01。正常组在培养24、48、72 h后的吸光度值分别为0.26±0.02、0.44±0．03、0.73±0.06，模拟物组分别为0.33±0.04、0.50±0.05、0.88±0.05，抑制物组分别为0.86±0．01、1.88±0.12、2.48±0.15，未转染组分别为0.62±0.01、1.63±0.02、2.34±0.23，正常组、模拟物组各时点分别与抑制物组、未转染组相比，P均<0.01。模拟物组、抑制物组、未转染组细胞凋亡率分别为11.91%±0.45%、5.23%±0.38%、6.77%±0.52%，模拟物组与抑制物组、未转染组相比，P均<0.01。模拟物组、抑制物组、未转染组MTDH蛋白的相对表达量分别为1.14±0.08、6.31±0.24、5.56±0.06，模拟物组与抑制物组、未转染组相比，P均<0.01。结论miRNA-30a-5p过表达可明显抑制肾癌细胞株786-0的增殖、促进细胞凋亡，其可能是通过调控MTDH蛋白表达实现的。

肾细胞癌；微小RNA-30a-5p；细胞增殖；细胞凋亡；异黏蛋白

肾癌是泌尿系统常见恶性肿瘤，在过去20年里其发病率呈现升高趋势。随着对肾癌发生、发展过程中分子机制的深入研究，寻找调控肾癌细胞增殖分化的相关基因，已成为肾癌分子生物学研究领域的热点。微小RNA(miRNA)自1993年被首次发现以来，大量研究证实miRNA参与了细胞的增殖、分化、凋亡。miRNA-30a系miRNA-30家族成员，编码基因定位于人类染色体6ql3,与很多恶性肿瘤相关[1]。已有研究指出miRNA-30a-5p是调控肝癌、肺癌等肿瘤发生、发展的重要因素。目前，miRNA-30a-5p在肾癌细胞中的作用未见研究报道。生物信息学预测研究显示异黏蛋白(MTDH)是miRNA-30a-5p可能作用的靶基因[2]。2014年7月～2016年7月，我们观察了miRNA-30a-5p过表达对肾癌细胞株786-0增殖凋亡的影响，并探讨其机制。

1 材料与方法

1.1 主要材料 肾癌细胞株786-0及正常人肾小管上皮细胞HK-2购自中国科学院上海细胞库；脂质体(LipofectamineTM2000)转染试剂购自美国Invitrogen公司；miRNA-30a-5p模拟物、抑制物、特异性茎环逆转录引物及PCR引物均购自广州锐博生物科技有限公司；CCK-8试剂盒(cell counting Kit-8)购自武汉博士德生物工程有限公司；RNA提取试剂盒、cDNA第一链合成试剂盒及SYBR Green实时荧光定量PCR试剂盒均购自北京TIANGEN生化科技有限公司。兔抗MTDH多克隆抗体购自北京博奥森生物技术有限公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 分别将肾癌细胞株786-0及人肾小管上皮细胞HK-2接种于含10%胎牛血清的RPMI1640培养基中，置于37 ℃、5% CO2的培养箱中培养，每2～3 d换培养液1次，视细胞生长情况用0.25%的胰酶消化每周传代1～2次，当细胞稳定呈对数生长期时开始用于实验。

1.2.2 细胞转染 将肾癌细胞株786-0分为模拟物组、抑制物组、未转染组，模拟物组转染miRNA-30a-5p模拟物，抑制物组转染miRNA-30a-5p抑制物，未转染组为正常肾癌细胞株786-0。转染前24 h于6孔板中接种模拟物组、抑制物组对数生长期细胞，细胞密度为2×105/mL。按照脂质体转染试剂的说明书进行转染miRNA-30a-5p模拟物或抑制物。每组设3个复孔，转染后用转染试剂于37 ℃在培养箱培养6 h，每孔中加入含有20%胎牛血清无抗生素的RPMI1640培养基。37 ℃培养箱培养至24 h，更换为新鲜含10%胎牛血清的RPMI1640培养基继续培养至48 h，收集细胞进行实验。

1.2.3 各组细胞miRNA-30a-5p mRNA表达检测 采用实时荧光定量PCR法。收集转染48 h后模拟物组、抑制物组、未转染组细胞，同时收集呈对数生长期的正常人肾小管上皮细胞HK-2(正常组)，按照RNA提取试剂盒说明书提取细胞总RNA，紫外分光光度计检测RNA浓度与纯度，反转录合成cDNA，实时荧光定量PCR法检测各组细胞miRNA-30a-5p mRNA的表达。每个样本重复3次。反应体系：SYBR Green Supermix 10 μL，上、下游引物各0.5 μL，cDNA样品1 μL,dH2O 8 μL，共计20 μL。反应条件：预变性95 ℃ 15 s，1个循环；PCR反应，95 ℃ 15 s，62 ℃ 30 s，40个循环；熔解曲线分析，95 ℃ 1 min，55 ℃ 1 min，95 ℃ 30 s，1个循环。扩增miRNA-30a-5p的同时，扩增管家基因U6。miRNA-30a-5p特异性茎环逆转录引物序列：5′-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGFFTTGAGCTTCCAGT-3′；上游序列:5′-CACTCTCATGTAAACATCCTCGAC-3′，下游序列：5′-TATGGTTGTTCTGCTCTCTGTGTC-3′；内参U6引物，上游序列：5′-ATTGGAACGATACAGAGAAGATT-3′，下游序列：5′-GGAACGCTTCACGAATTTG-3′。将正常组设为对照，标准化为1，采用2-ΔΔCt法分析各组miRNA-30a-5p mRNA的相对表达量。

1.2.4 各组细胞增殖情况观察 采用CCK-8法。制备上述4组单细胞悬液，将1×103～1×104/mL细胞接种于96孔板，每孔体积100 μL，每组设3个复孔。37 ℃、5% CO2及饱和湿度条件下培养，细胞贴壁后，模拟物组、抑制物组转染miRNA-30a-5p模拟物和抑制物。将转染后6 h换液时间作为CCK-8实验的0 h，分别培养24、48、72 h后加入10 μL CCK-8溶液，37 ℃继续孵育4～6 h，终止培养，吸弃上清液。每孔加入150 μL DMSO，振荡10 min，酶联免疫检测仪上测定490 nm波长各孔吸光度值，记录结果。

1.2.5 各组细胞凋亡情况观察 将6孔板中转染48 h后模拟物组、抑制物组、未转染组细胞用胰酶消化后，收集细胞悬液于室温下离心5 min。弃上清液后收集细胞，用4 ℃预冷的PBS洗涤细胞2次。离心，收集细胞，用250 μL稀释的混合缓冲液重新悬浮细胞，调整细胞密度不少于1×105/mL。取100 μL细胞悬液，加入5 μL的Annexin V-FITC与1 μL的碘化丙锭染色，混匀后室温下避光孵育15 min。加400 μL的1×PBS缓冲液于流式细胞仪检测细胞凋亡的情况。实验重复3次,取平均值。

1.2.6 各组细胞MTDH蛋白表达检测 采用Western blotting法。收集转染48 h后模拟物组、抑制物组、未转染组细胞，提取细胞总蛋白，检测样品蛋白含量。分别取样品蛋白20 μg加上样缓冲液至终体积15 μL，以10%聚丙烯酰胺凝胶电泳分离并转移到硝酸纤维素滤膜上。取出硝酸纤维素滤膜，置于5%脱脂奶粉(用PBS配制)室温2 h封膜。加入MTDH一抗(1 μL一抗加入0.02 mmol/L PBST 2 mL)4 ℃孵育过夜，0.02 mmol/L PBST洗膜3次。加入二抗室温孵育2 h，洗膜3次。DAB显色。凝胶成像系统分析结果。

2 结果

2.1 各组细胞miRNA-30a-5p mRNA表达比较 正常组、模拟物组、抑制物组、未转染组细胞miRNA-30a-5p mRNA相对表达量分别为1.00±0.00、1.32±0.05、0.32±0.05、0.52±0.06，正常组、模拟物组、抑制物组与未转染组相比，P均<0.01。

2.2 各组细胞增殖活性比较 正常组在培养24、48、72 h后的吸光度值分别为0.26±0.02、0.44±0．03、0.73±0.06，模拟物组分别为0.33±0.04、0.50±0.05、0.88±0.05，抑制物组分别为0.86±0．01、1.88±0.12、2.48±0.15，未转染组分别为0.62±0.01、1.63±0.02、2.34±0.23，正常组、模拟物组各时点分别与抑制物组、未转染组相比，P均<0.01。

2.3 各组细胞凋亡率比较 模拟物组、抑制物组、未转染组细胞凋亡率分别为11.91%±0.45%、5.23%±0.38%、6.77%±0.52%，模拟物组与抑制物组、未转染组相比，P均<0.01。

2.4 各组细胞MTDH蛋白表达比较 模拟物组、抑制物组、未转染组MTDH蛋白的相对表达量分别为1.14±0.08、6.31±0.24、5.56±0.06，模拟物组与抑制物组、未转染组相比，P均<0.01。

3 讨论

肾癌占成人恶性肿瘤的2%～7%，早期肾癌主要采取手术治疗，但手术方式的进步并未显著提高肾癌患者的生存率。由于肾癌细胞的生物学行为复杂多变，且具有放化疗抵抗特点，近30%的手术患者术后3年内肿瘤复发，总体5年生存率不到10%[3]。因此，研究调控肾癌细胞增殖分化的相关基因，通过靶向抑制，对提高肾癌患者的生存率，具有重要意义。

miRNA作为新兴的生物标志物，有望成为肾癌诊断治疗及判断预后的重要靶点。miRNA在肿瘤的发生与发展过程中，既可以表达上调发挥致癌基因的作用，也可以表达下调发挥抑癌基因的作用[4]。并且，肿瘤细胞对抗肿瘤药物的敏感性亦受miRNA的影响[5]。目前，miRNA在肾肿瘤中的研究还处在初级阶段。Chow等[6]发现，33种miRNA在肾透明细胞癌组织中发生改变，其中21种呈高表达的miRNA在肾透明细胞癌的发生、发展中起非常重要的作用。肾细胞癌体内体外实验显示，miRNA-137通过抑制磷酸肌醇3激酶/蛋白激酶B信通路抑制肾癌细胞生长[7]。此外，多项研究[8～10]显示miRNA-141-3p、miRNA-145-5p、miRNA-218及miRNA-27a等均在肾癌中起抑癌基因作用。但另有研究[11]发现miR-630在肾癌细胞中扮演着促癌基因的角色。

miRNA-30家族的成员包括miRNA-30a、miRNA-30b、miRNA-30c、miRNA-30d、miRNA-30e等，miRNA-30a产生于内含子翻译单位，有miRNA-30a-3p、miRNA-30a-5p两种形式[1]。近年研究发现miRNA-30a/miRNA-30a-5p可在卵巢癌、乳腺癌、肝癌、白血病等多种肿瘤中发挥抑癌作用[12～15]，然而miRNA-30a-5p在肾癌细胞中的作用未见研究报道。本研究结果发现，未转染组较正常组miRNA-30a-5p表达下调，且与抑制物组、未转染组比较，模拟物组细胞增殖能力明显下降，细胞凋亡明显增加。上述实验结果提示miRNA-30a-5p的高表达可抑制肾癌786-0细胞增殖，促进细胞凋亡，miRNA-30a-5p在肾癌的发展中起抑癌基因的作用。

MTDH在多种肿瘤(如肝癌、卵巢癌、子宫内膜癌等[16～18])中呈高表达，增加肿瘤细胞的侵袭性，并介导多种形式的化疗抵抗。Li等[2]通过荧光素酶活性分析实验证实MTDH是miRNA-30a-5p的直接靶向基因，在肝癌组织中，miRNA-30a-5p的表达与MTDH的表达具有明显的负相关。亦有实验表明，miRNA-30a可通过MTDH实现对乳腺癌肿瘤细胞的抑制作用[19]。秦丹丹等[20]研究认为，MTDH与miRNA-30a结合位点具有物种保守性。在肾癌细胞中转染miRNA-30a类似物后，MTDH表达被抑制，MTDH与miRNA-30a具有靶向关系。此外，通过上调miR-30d的表达可靶向Akt/FOXO抑制MTDH的表达，从而抑制肾癌细胞的增殖，促进其凋亡[21]。本研究结果发现，模拟物组MTDH蛋白的相对表达量较未转染组及抑制组明显下降，提示miRNA-30a-5p可能通过靶向MTDH而抑制肾癌细胞株786-0的增殖，促进细胞凋亡。

综上所述，miRNA-30a-5p在肾癌细胞中起抑癌基因的作用，其可能是通过调控MTDH蛋白表达实现的。但是，同一miRNA可以调控多个靶基因，不同的miRNA分子也可协同调控同一靶基因。miRNA与它们的靶基因组成了一个复杂的调控系统。因此，还应该进一步研究肾癌细胞中异常表达的miRNA之间的相互联系，为肾癌的早期诊断治疗提供新的分子生物学靶点。

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EffectsofoverexpressionofmiRNA-30a-5ponproliferationandapoptosisofrenalcarcinomacellline786-0

LAIWeidong1,DAIZunshou,ZHAOAiguo,HUNa,LIULinlin,GURunguo

(1ShandongMedicalCollege,Linyi276000,China)

ObjectiveTo observe the influence of overexpression of miRNA-30a-5p on the proliferation and apoptosis of renal carcinoma cell line 786-0, and to explore the mechanism.MethodsThe renal carcinoma 786-0 cells were divided into the mimic group, the inhibitor group, and the non-transfected group. The cells in the mimic group were transfected with miRNA-30a-5p mimics, cells in the inhibitor group were transfected with miRNA-30a-5p inhibitor, and in the non-transfected group, the cells were normal renal carcinoma 786-0 cells. The expression of miRNA-30a-5p mRNA in the mimics group, inhibitor group, non-transfected group, and normal human renal tubular epithelial cells HK-2 (normal group) were detected by real-time fluorescence quantitative PCR; the cell proliferation at 24, 48, and 72 h after transfection was evaluated by using CCK-8 assay; the apoptosis of the former three groups was assessed by flow cytometry; the expression of MTDH protein in the former three groups was detected by Western blotting.ResultsThe miRNA-30a-5p mRNA expression in the normal group, mimic group, inhibitor group, and non-transfected group was 1.00±0.00, 1.32±0.05, 0.32±0.05, and 0.52±0.06, respectively; significant difference was found between the normal group, mimic group, inhibitor group, and the non-transfected group (allP<0.01). The absorbance values of the normal group at 24, 48, and 72 h were 0.26±0.02, 0.44±0.03, and 0.73±0.06, respectively; the absorbance values of the mimic group were 0.33±0.04, 0.50±0.05, and 0.88±0.05, respectively; in the inhibitor group they were 0.86±0.01, 1.88±0.12, and 2.48±0.15, respectively; in the non-transfected group, they were 0.62±0.01, 1.63±0.02, and 2.34±0.23, respectively; significant difference was found between the normal group, the mimic group, and the inhibitor group and the non-transfected group at each time point, allP<0.01. The apoptosis rates in the mimic group, inhibitor group, and non-transfected group were separately 11.91%±0.45%, 5.23%±0.38%, and 6.77%±0.52%; significant difference was found between the mimic group and between the inhibitor group and non-transfected group, allP<0.01. The expression levels of MTDH protein in the mimic group, inhibitor group, and non-transfected group were separately 1.14±0.08, 6.31±0.24, and 5.56±0.06, and significant difference was found in the expression of MTDH protein of the mimic group as compared with that of the inhibitor group and non-transfected group, allP<0.01.ConclusionOverexpression of miRNA-30a-5p may inhibit 786-0 cell proliferation and promote the apoptosis by regulating the expression of MTDH.

renal cell carcinoma; micro RNA-30a-5p; cell proliferation ; apoptosis; metadherin

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.38.007

R737.11

A

1002-266X(2017)38-0023-04

山东省高等学校科技计划项目(J13LL08);山东省临沂市科技发展计划项目(201515055)。

来卫东(1978-)，男，副教授，主要研究方向为泌尿系肿瘤的分子机制。E-mail: lwddoctor@126.com

顾润国(1966-)，男，教授，主要研究方向为泌尿系肿瘤的分子机制。E-mail: geda576@163.com

2017-04-10)