miR-122对脑缺血再灌注损伤小鼠脑梗死体积及胰岛素样生长因子-1受体通路的影响

廖晓斌 刘子彪 吕志成 康承湘

（郴州市第一人民医院，郴州 423000）

脑卒中在人群中的发病率逐年上升[1]。脑卒中溶栓治疗后可发生脑缺血再灌注损伤（ischemia/reperfusion，I/R），极易诱导脑神经细胞凋亡或多种脑组织损害。I/R 是由多因素参与的一种较为复杂的级联反应，包括氧自由基作用、炎症反应、钙浓度增加等[2-3]。miR-122 是机体组织特异性微小RNA，参与机体神经发育，在脑组织缺血、缺氧及脑梗死的发生过程中都有调节作用，与脑梗死的病情和预后直接相关[4]。miR-122 与缺血再灌注损伤的发生密切相关，如小鼠脑缺血再灌注中，miR-122 对降低胰岛素样生长因子-1 受体（insulin like growth factor-1 receptor，IGF-1R）表达起调控作用，降低脑细胞的损伤[5]。近年来，研究表明IGF-1R 通路紊乱与脑部各种损伤疾病，如糖尿病脑病、阿尔茨海默病、癫痫等也存在一定关联。IGF 包含3 类肽类激素，如IGF-1、IGF-2 等[6-7]，而IGF-1 及其受体IGF-1R 在机体组织中存在较广，尤其是在脑组织中，IGF-1 可与受体结合，激活下游信号转导，从而抑制脑部神经细胞凋亡，促进存活，在改善动物和人脑损伤中有重要意义，有效控制IGF-1R 信号紊乱，能明显促进神经元损伤的恢复[8-9]。由此，本研究旨在探讨miR-122 对脑缺血再灌注损伤小鼠脑梗死面积及IGF-1R 通路的影响。

1 材料和方法

1.1 主要试剂和仪器

TRIzol 试剂（浙江AMEKO）；逆转录试剂盒（武汉，赛维尔）；RT-PCR 试剂盒（上海吉玛制药技术有限公司）；SPF 级雄性 C57BL 小鼠（长沙，天勤生物），体质量23.51 g±1.47 g，11 周龄，自由饮食、饮水，温度24℃±1℃，湿度50%左右。

1.2 分组处理

40 只小鼠分为对照组（假手术组）、模型组（I/R 模型组）、模拟物组（I/R 模型+miR-122 模拟物）、抑制物组（I/R 模型+miR-122 抑制物）。用10% 水合氯醛腹腔注射麻醉模拟物组、抑制物组小鼠，麻醉后固定于脑定位仪上，取7 μL 的miR-122 模拟物、miR-122 抑制物混悬液分别注射至模拟物组、抑制物组小鼠左侧脑室，速度3 μL/min，留针5 min。

1.3 模型制备

线栓法制备I/R 模型。动物术前禁食12 h，可饮水，选用戊巴比妥钠30 g/L 进行腹腔注射麻醉。术区消毒切开颈部皮肤，左侧颈总动脉小切口，将0.18 mm 经处理过的线栓于颈总动脉深入颈内动脉，直至脑部中动脉，有轻微阻力即可停止深入。缺血1 h 后撤除线栓。术中保持小鼠肛温处于36℃～37℃。对照组分离颈动脉后缝合。

1.4 神经行为学检测

撤除线栓后，观察小鼠行为改变，行阿扑吗啡旋转诱导实验，统计用药30 min 内小鼠旋转圈数，计算平均旋转圈数。末次给药结束后行悬挂实验，将小鼠前肢悬挂于距地面30 cm 水平放置的金属丝上，记录从开始悬挂至落地时的时间并评分。评分标准为：持续0～5 s 记为0 分，6～10 s 记为1 分；11～15 s 记为2 分，16～20 s 记 为3 分，21～25 s 记为4 分，26～30 s 记为5 分，超过30 s 记为6 分。共检测3 次，取平均值，每次检测时间间隔约为2 min。

1.5 Morris 水迷宫实验

每组小鼠取10 只进行Morris 水迷宫实验。

记忆训练期（第1、2 天）：将小鼠面朝池壁放入水中游泳60 s，第1 天引导小鼠登上平台，第2天若在60 s 内动物没有登上平台则继续引导其登上平台，停留15 s 后放入温暖干燥的笼子结束训练。

记忆增强期（第3、4、5 天）：每只动物每天早、晚各1 次实验，每次分别从除平台所在方位外的3个方位各放1 次，每只动物放入水中的间隔时间为15 s。动物单次游泳时间为60 s，若小鼠在60 s 内不能上台则引导其登上平台适应15 s 后进行下次实验。最后，将小鼠擦干放入鼠笼。

空间探索实验（第6 天）：撤出平台，将小鼠从与平台相对的方位面朝池壁放入水中，让小鼠自由游泳60 s 后将动物擦干放入鼠笼。观察小鼠在平台所有象限的距离百分比（PT%）和停留时间百分比（T%），以此来评价药物对小鼠神经行为学障碍的影响（PT%和T%值越大，表明大鼠的认知记忆能力越强）。

1.6 小鼠脑梗死体积检测

2 周后麻醉处死小鼠取脑，将取出的脑组织冷冻30 min，对脑组织间隔2 mm 做6 个冠状切片，并采用10%的2,3,5-三苯基氯化四氮唑（TTC）进行水浴染色，正常组织呈红色，缺血坏死呈白色，用NIS—Elements BR3.0 基础研究图像分析软件对切片脑梗死体积进行测定。采用单盲法，即盲图像分析，计算脑梗死灶体积。

1.7 H-E 染色

取各组小鼠脑组织，固定于多聚甲醛溶液中，用石蜡包埋脑组织，切成5 μm 的薄片，H-E 染色组织薄片，封片后显微镜下观察组织病理学变化。

1.8 RT-PCR 检测miR-122、IGF-1R 水平

将胰蛋白酶加入小鼠脑组织中进行消化反应，PBS 冲洗，然后滴入0.9%NaCl 溶液，总RNA 采用TRIzol 法来提取，总RNA 再反转录成 cDNA。实验步骤按试剂说明书操作，用DNA 荧光染料SYBR Green Ⅰ对miR-122、IGF-1R mRNA 表达水平进行检测，内参采用β-actin，60℃ 10 min，95℃ 72℃，各 30 s、95℃，5 min，循环次数40，用相对定量2-ΔΔCT计 算miR-122、IGF-1R mRNA 表 达 量。实验次数至少3 次。引物序列见表1。

表1 引物序列

1.9 免疫印迹检测IGF-1R 蛋白表达

取出各组小鼠脑组织，称重后剪碎组织，用裂解液裂解组织成组织悬液，13 000 r/min 离心15 min，收集上清液，用BCA 法对总蛋白浓度进行测定。完成配胶、电泳分离蛋白，以marker 确定目标蛋白位置、转膜、洗膜、封闭液室温封闭，分别孵育一、二抗，用ECL 发光剂显影曝光，分析目标蛋白灰度值，并用各自的内参校正。

1.10 流式细胞术检测神经元细胞凋亡情况

取脑组织加入裂解液，制备细胞悬液，对其进行洗涤2 次，离心5 min，选择100 μL 的1×结合缓冲液，进行重悬细胞操作，用5 μL 标记FITC的Annexin Ⅴ与5 μL PI 染色液混匀，避光孵育15 min 后加入400 μL 结合缓冲液，混匀，洗涤3 次后上机检测。

1.11 统计学处理

采用SPSS 17.0 统计学软件进行数据分析，计量资料以±s表示，组间比较采用单因素方差分析，两两组间比较采用LSD-t检验，以P<0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 小鼠神经功能比较

与对照组相比，模型组和模拟物组小鼠旋转圈数明显增多，悬挂实验评分降低，且模拟物组小鼠旋转圈数多于模型组，悬挂实验评分低于模型组（P<0.05）；与模型组相比，抑制物组小鼠旋转圈数明显减少，悬挂试验评分明显升高（P<0.05）（表1）。

表1 各组小鼠旋转圈数和评分比较（n=10，±s）

表1 各组小鼠旋转圈数和评分比较（n=10，±s）

△P<0.05 vs 对照组；*P<0.05 vs 模型组；#P<0.05 vs 模拟物组

组别 旋转圈数（圈） 悬挂实验评分对照组 5.02±1.10 1.17±0.31模型组 12.35±3.24△ 0.53±0.16△模拟物组 15.37±4.46△* 0.32±0.13△*抑制物组 7.21±1.57△*# 0.93±0.28△*#

2.2 小鼠认知功能比较

与对照组相比，模型组和模拟物组小鼠PT%、T%值均降低，且模拟物组较模型组降低的更为显著（P<0.05）；与模型组相比，抑制物组小鼠PT%、T%值显著升高（P<0.05）（表2）。

表2 各组大鼠PT%、T%比较（n=10，±s）

表2 各组大鼠PT%、T%比较（n=10，±s）

△P<0.05 vs 对照组；*P<0.05 vs 模型组；#P<0.05 vs 模拟物组

组别 PT（%） T（%）对照组 40.23±5.54 35.19±4.32模型组 26.14±3.01△ 25.51±3.68△模拟物组 21.56±2.72△* 20.23±2.71△*抑制物组 35.27±4.16△* 31.72±3.18△*

2.3 小鼠脑梗死体积

对照组小鼠脑组织无梗死。与对照组相比，模型组（45.13±5.22）mm3和模拟物组（61.08±10.31）mm3小鼠脑梗死体积显著增加，且模拟物组小鼠脑梗死体积大于模型组（P<0.05）；与模型组相比，抑制物组（28.67±8.18）mm3小鼠脑梗死体积显著减少（P<0.05）（图1）。

图1 小鼠脑梗死体积比较。

2.4 脑组织神经元形态

H-E 染色显示对照组脑组织结构完整，神经元排列紧密，无染色不匀现象；模型组脑组织神经元排列呈疏松状态，着色不匀，有大量空泡样病理结构改变；模拟物组脑组织结构改变较模型组严重；抑制物组脑组织损伤病理变化逐渐减弱，神经元排列较密，空泡样病理改变减少（图2）。

图2 脑组织H-E 染色，×200。

2.5 脑组织miR-122、IGF-1R mRNA 水平变化

与对照组相比，模型组和模拟物组miR-122 水平均显著增加，IGF-1R mRNA 水平均显著降低，且模拟物组中miR-122、IGF-1R mRNA 变化较模型组显著（P<0.05）；与模型组相比，抑制物组miR-122 水平显著降低，IGF-1R mRNA 水平显著升高（P<0.05）（表3）。

表3 各组小鼠脑组织中miR-122、IGF-1R mRNA水平比较（n=10，±s）

表3 各组小鼠脑组织中miR-122、IGF-1R mRNA水平比较（n=10，±s）

△P<0.05 vs 对照组；*P<0.05 vs 模型组；#P<0.05 vs 模拟物组

组别 miR-122 IGF-1R对照组 2.71±0.13 1.68±0.10模型组 4.98±0.16△ 0.73±0.15△模拟物组 7.11±0.18△* 0.52±0.13△*抑制物组 2.03±0.14△*# 1.01±0.10△*#

2.6 脑组织中IGF-1R 蛋白表达

与对照组相比，模型组和模拟物组中IGF-1R蛋白表达明显降低，且模拟物组中IGF-1R 蛋白表达低于模型组（P<0.05）；与模型组相比，抑制物组中IGF-1R 蛋白表达显著增加（P<0.05）（图3）。

图3 大鼠组织IGF-1R 蛋白表达情况

2.7 神经元细胞凋亡情况

流式细胞术检测显示神经元细胞凋亡率从高到低依次为模拟物组、模型组、抑制物组、对照组组，4 组神经元细胞凋亡率比较差异有统计学意义（P<0.05）（图4）。

图4 大鼠神经元细胞凋亡情况

3 讨论

缺血性脑血管疾病多因血流突然停止或减少引起，或由于溶栓后，缺血区血流量正常却呈现更加严重的脑损伤即脑I/R，其发病机制较为复杂，涉及致病因素较广，给临床治疗带来阻碍[10]。近年来，miR-122 在临床研究、实践中得到更多关注，特别是在对I/R 功能恢复方面。IGF-1R 在脑内表达十分丰富，如大脑皮层、海马、下丘脑中均有表达，对乙酰胆碱产生有调控作用，可以抑制神经元凋亡，与认知功能异常密切相关[11-12]。根据病因和目标疗法的研究基础，miR-122 和IGF-1R 以及一些关联因子慢慢地被用于I/R 的治疗[13]。

本研究结果显示，4 组脑梗死体积大到小为模拟物组、模型组、抑制物组、对照组。对照组脑组织结构完整，神经元排列紧密，无染色不匀现象。模型组脑组织神经元排列呈疏松状态，着色不匀，有大量空泡样病理结构改变。模拟物组脑组织结构改变较模型组严重。抑制物组脑组织损伤病理变化逐渐减弱，神经元排列较密，空泡样病理改变减少。相关研究报道，miR-122 是I/R 发生的关键因素，在正常机体内的变化具有规律性，而在I/R患者体内会出现异常升高，因此，miR-122 对于维持机体血管功能和重要器官正常运转具有重要作用[14]。本研究结果显示，模型组和模拟物组小鼠旋转圈数增加，悬挂实验评分显著降低，干预后的抑制物组小鼠旋转圈数减少，悬挂实验评分升高，提示miR-122 可改善缺血再灌注小鼠神经功能。水迷宫实验通过PT%和T%指标评估小鼠的空间学习记忆能力，两者数值越大，说明小鼠的空间认知记忆越好。本研究结果显示，抑制物组小鼠PT%和T%值显著高于模型组，提示miR-122 能增强脑I/R 小鼠认知记忆能力，改善神经行为学障碍。有研究证实，miR-122 可抑制2-Ag 代谢的突触和认知改善，参与了I/R 的病理生理机制，是诱发I/R 造成脑梗死的潜在生物学标志[15]。miR-122 表达上升可抑制脑组织相关信号通路活性，如IGF-1R 通路等，对脑缺血后脑组织的修复产生抑制效果，神经元呈现缺血状态，患者脑出血病情加重，诱发I/R[16]，这与本研究结果相符。

本研究结果显示，与对照组比较，模型组miR-122 水平呈显著升高状态，其余3 组miR-122水平从高到低依次为模拟物组、模型组、抑制物组。抑制物组IGF-1R 蛋白表达高于模型组、模拟物组；与对照组比较，模型组IGF-1R 蛋白表达明显下降。神经元细胞凋亡从高到低依次为模拟物组、模型组、抑制物组、对照组。相关文献报道，IGF-1R 是一种异常活跃的信号通路，通过激酶反应增加活性使其磷酸化，特定靶基因受到磷酸化影响，开始转录，并诱导相关蛋白表达，影响细胞增殖、分化和凋亡[17-18]。有研究报道，IGF-1R 信号通路与脑出血引起的脑水肿产生有关联，增强IGF-1R 活性能效减少脑神经细胞凋亡，对体内的炎症反应产生抑制效果，提高脑组织微循环及血流[19]。IGF-1R 活性增强可促进脑内血管分支的建立及全身血液循环，脑缺血区神经递质水平得到稳定调节，神经细胞凋亡被抑制，达到减缓疾病进程的目的[20]。

综上所述，miR-122 低表达可减少脑缺血再灌注损伤小鼠脑梗死体积，增加IGF-1R 通路活性，对脑缺血再灌注损伤小鼠脑组织有一定的保护作用。