比格犬下肢缺血模型的建立

王 杰，张世勇，王 雪，王成伟

新疆医科大学第六临床医学院骨病矫形科 乌鲁木齐 830002

下肢缺血的主要原因是下肢动脉发生硬化及闭塞，其发生率和致残率都较高，极大影响患者肢体功能和生活质量。引起下肢缺血的疾病主要有下肢动脉硬化闭塞症、血栓闭塞性脉管炎和较为特殊的糖尿病足。这些疾病主要累及下肢的中、小动脉，其中膝关节下方的动脉最为常见[1-2]，主要临床表现为下肢静息痛、溃疡，甚至坏疽[3-4]。目前主流的治疗方法为重建下肢血运的动脉旁路移植和腔内治疗，但两者治疗的失败率都较高[4-5]，因此对于下肢缺血疾病的研究意义重大。目前研究下肢缺血的动物实验多以鼠、兔为实验对象，通常结扎髂总动脉和股动脉等血管。鼠、兔作为小型动物，饲养及操作简单，费用低廉。对于结扎目标来说，结扎端越靠近心端，所干预肢体组织炎症、坏死等缺血症状越明显，但髂总动脉和股动脉等大动脉结扎所致的急性完全缺血状态，不符合膝下中、小血管损伤的临床特征，不能模拟下肢动脉硬化闭塞所导致的慢性不完全缺血状态。本研究以比格犬为实验对象，拟建立缺血效果明显同时又具有慢性不完全缺血特征的大型动物模型，为研究下肢动脉硬化闭塞所致的下肢缺血疾病提供更为理想的实验动物模型。

1 材料与方法

1.1材料6只12月龄健康比格犬由新疆医科大学实验动物中心提供，批号SYXK(新)2018-0002，均为雌性，体重(15.7±0.6) kg，身长(55.0±2.0)cm，胫骨长度(11.0±0.8) cm。速眠新Ⅱ(1.5 mL，敦化圣达动物药品有限公司)，舒泰(1.5 mL，法国维克有限公司)，头孢唑林钠(1.0 g，华民药业有限公司)，碘帕醇注射液(300 g/L，北京北陆公司)。18G静脉留置针(苏州林华公司)，数字减影血管造 影机[AXIOM Artis MP，西门子(中国)有限公司]，注射器(山东威高有限公司)。本研究获得新疆医科大学动物实验伦理委员会授权。

1.2建模方法比格犬术前12 h严格禁食禁水。麻醉：抽取0.5 mL速眠新Ⅱ与0.5 mL舒泰，于前肢皮下肌肉组织丰富处予以肌内注射。麻醉生效后，将比格犬仰卧位固定于手术台上，固定四肢，臀部垫高，膝关节屈曲30°。于前肢大腿建立静脉通道，输注100 mL 50 g/L葡萄糖。比格犬双下肢术区备皮消毒后，于犬膝关节前内侧行约7 cm斜形切口，钝性分离筋膜，用拉钩牵开大腿缝匠肌后部与股薄肌，分离肌层可探查到股动脉。再用拉钩向后牵开半膜肌和腓肠肌，自股动脉向下找到腘动脉及毗邻的神经血管束。腘动脉进入腘窝后方斜行向下，位置较深，紧贴于股骨腘平面、膝关节囊和腘肌的后方，至腘肌下缘分为胫前、胫后动脉，分别进入小腿前、后面。分离伴行静脉与神经，用血管钳游离腘动脉，可观察并触及明显搏动，频率与心率一致。将腘动脉双头结扎，离断腘动脉。在腘动脉离断点近心端可触及血管搏动，远心端则无明显搏动。用生理盐水冲洗伤口后逐层闭合皮下组织。见图1。无菌纱布覆盖创面后以弹力绷带捆扎，运回动物房。术后3 d连续肌内注射头孢唑林钠抗感染，加强营养。

1.3DSA造影麻醉生效、下肢缺血模型构建前及术后1周、2周，将比格犬仰卧位固定于DSA机床上。在大腿内侧中上段寻找股动脉，触及动脉搏动最明显处，确定穿刺部位。使用18G套管留置针经皮向远心端顺行穿刺股动脉，穿刺见回血后使用胶带临时固定，针尾接肝素与生理盐水混合的抗凝剂。为防止造影中肢体抖动，牵拉固定实验犬后肢。手动匀速推注按2∶1稀释的30 mL对比剂，10 s内完成。由专业影像技师处理造影结果。造影结束后拔除留置针，用力按压穿刺点5 min止血。

A：双下肢备皮固定； B:游离腘动脉；C:结扎腘动脉；D:缝合切口

2 结果

比格犬腘动脉结扎手术时间为27～35 min，术中均未补注麻药。手术结束后40 min比格犬均自然苏醒，未出现死亡。但因麻醉效果未完全消退，表现为精神萎靡，皮温较低，食欲较差，不愿进行主动活动。结扎侧下肢明显肿胀，被动活动时抵抗阻力能力较弱，肌力较术前下降，跛行明显。术后第1天食欲恢复，均正常进食，精神可，手术切口干净无渗出，周围可见不同程度的淤血水肿，跛行消失，步态正常，肌力恢复，下肢活动可，皮温仍较低。有1只在术后第3天出现左下肢局部皮肤破溃现象。缺血模型建立1周后行第2次造影，造影剂自股动脉下行至腘动脉结扎处中断，不能通过胫前动脉、胫后动脉到达下肢，也无明显的侧支循环建立。术后2周行第3次造影，结果同前。6只比格犬共计行3次双下肢血管造影，收集图像36帧，其中有2帧图像质量差。腘动脉双头结扎前及结扎后1周动脉影像见图2。

图2 比格犬腘动脉双头结扎前(A)及结扎后1周(B)动脉影像

3 讨论

下肢动脉硬化闭塞所导致的局部血管病变会严重影响下肢血运，妨碍组织吸收足量营养，造成血管内皮因子形成障碍。因此重建下肢血运、恢复组织微循环成为治疗的核心重点。横向骨搬移技术以Ilizarov所主张的张力-应力法则为理论依据，通过缓慢持续牵伸胫骨，激活组织修复潜力，使骨骼、血管、肌肉、神经同步增生，实现血运的重建和组织微循环的恢复，从而治愈下肢缺血疾病。但目前胫骨横向骨搬移技术临床应用较少，需经动物实验评估疗效与安全性。因此一个稳定的缺血动物模型意义重大。本研究致力于建立模拟下肢动脉硬化闭塞所导致的慢性不完全缺血状态的动物模型。

3.1比格犬动物模型的优势利用动物模型作为基础平台研究疾病的病因与发展是一种简单有效、方便可靠的技术手段[6]。兔、犬、鼠在大体结构、生理及病理状态等方面与人相似，常作为血管疾病的动物模型。Verkest[7]研究发现用致人肥胖的饮食饲养犬类，未发现糖代谢紊乱、脂类代谢紊乱或其他血管疾病，因此利用饮食诱导出糖尿病足的下肢缺血模型较为困难，但是与鼠、兔等小型动物相比，犬在骨骼、血管等方面与人更为接近，可利用结扎血管建立模型。比格犬是获得国际认可的标准实验犬，生物学特性稳定，遗传变异程度低，个体差异不大，性格良好，不易染病，适合饲养。研究[8-9]表明在采用比格犬模型研究新型内固定材料时，比格犬骨骼形态和规格与人体接近，可用以测试人体标准尺 寸的螺钉及钢板等内固定材料，并且比格犬肌肉发达，其肌肉力量负荷可达到人的力量负荷，在应力模拟和稳定性方面具有优势。本研究建立下肢缺血模型后，还要对胫骨进行截骨、对骨块进行搬移等操作，这对于实验动物的骨骼条件有着较高要求。比格犬相较兔、鼠等小型动物而言有着更大的操作空间和更直观的实验结果。此外，相较猪、猴子等大型动物，比格犬购买及饲养费用更为低廉，因此选择比格犬作为此次研究的实验动物。

3.2下肢缺血模型的制备根据缺血效果将缺血动物模型分为暂时缺血和永久缺血两大类[10]。暂时缺血模型适用于肢体缺血再灌注损伤防治的研究。而永久缺血模型在缺血损伤、血管新生、细胞移植以及基因转染等方面应用最为广泛，是目前国内外肢体急、慢性缺血模型的主流方法[11-13]。永久缺血模型制备方法较多，主要为结扎血管法和栓塞血管法，制备方法以结扎后肢的供血动脉主干及其分支多见，备选的动脉以股动脉、髂动脉等为主，缺血程度依次递增。但是通过结扎股动脉所致的急性缺血与下肢动脉硬化闭塞所致的慢性缺血存在明显差异。结扎的血管水平位置越高，下肢局部发生炎症、坏死等缺血症状越显著。Tam等[14]在大鼠的右侧股动脉低位和腘动脉高位进行结扎，并保留其他侧支循环，这种不完全缺血状态与糖尿病足的慢性缺血状态更为相似。而结扎比格犬股动脉虽然可以完全阻断动脉供血和静脉回流，但可能会出现急性缺血肿胀以及严重的局部炎症反应，对后续研究产生不利影响。而腘动脉作为股动脉的分支，通过对其充分游离、结扎离断能阻断下肢血液供应，同时保留了隐动脉，形成不完全缺血状态，创伤小、血肿程度轻，局部炎症反应小，效果显著。本研究应用此方法近似模拟下肢慢性不完全缺血状态，成功建立了比格犬下肢缺血模型。

3.3DSA技术的优势目前DSA技术在临床上应用已相对成熟，常作为血管疾病诊断的“金标准”。动脉循环的精确成像对于糖尿病足、下肢动脉炎等外周动脉疾病的诊断、血运重建和预后评估尤为重要[15-16]。Blagojevic等[17]研究提出DSA技术可以精准反映下肢动脉循环状况，明确病灶和判断累及组织范围，对诊疗方案的制定有着辅助性的参考意义。传统缺血动物模型中常于处死动物后运用染料示踪法对缺血血管及侧支进行观察，操作精细复杂，易受染料黏稠度、 灌注压力等因素影响，不能真实反映血管的生理与病理状态。本次研究对活体比格犬进行造影，循环处于正常状态，结果更为严密准确。6只比格犬共计行3次双下肢血管造影，收集图像36帧；其中有2帧图像质量差。其原因是这2次造影未预先对碘帕醇进行稀释，推注时比格犬因为疼痛刺激移动后肢产生运动性伪影，成像不佳；后将碘帕醇与生理盐水以2∶1比例稀释后造影效果良好。此外，实验所应用的18G留置针相比导丝穿刺股动脉，局部创伤小，操作更为简单，结果也更为直观，所需费用低廉，但对于穿刺者的熟练度要求相对较高，针头方向与进针深度对于穿刺的成功极为重要，在避免刺破大动脉的同时还要保证不因进针太浅导致留置针脱出从而造成造影失败。

总之，本研究通过对腘动脉双头结扎离断建立了比格犬下肢缺血模型，缺血效果相对统一，结果稳定，操作简单，可重复性好，是一种简单易行、有效的下肢缺血模型的制作方法。