UPLC-MS/MS研究36 个梨品种成熟果实中的特征性多酚和三萜酸类物质

孙莉琼，郝雯菁，唐晓清，王康才，张绍铃

（南京农业大学园艺学院，江苏 南京 210095）

梨为蔷薇科梨属植物（Pyrusspp.），果实大多可食用，而且还具有抗氧化、抗炎、润肺止咳、通便秘、利消化、降血糖、降血脂、醒酒、预防胃黏膜病变等功效[1-3]，是广大人民最受欢迎的药食两用水果之一。李时珍《本草纲目》中有记载：“梨品甚多，俱为上品，可治百病。润肺凉心，消痰降火，解疮毒酒毒”。自古以来，更有“冰糖雪梨”、“雪梨枇杷汤”、“鲜梨贝母汤”等经典民间验方流传至今。特别是随着近年来人们对绿色健康食品的热衷和科技现代化进程加快，许多含梨中成药及保健产品被陆续开发上市，如“止咳梨浆”、“秋梨润肺膏”、“梨汁润肺茶”、“雪梨膏”、“梨膏糖”等，有的甚至被作为地方经济产业大力发展[4-5]。然而，目前已上市的梨相关功能性产品中除了极少数对配方用梨的品种有明确规定，大多数还存在品种混用现象，难以实现对产品质量的全面控制。我国为梨种植大国，种质资源相当丰富，据不完全统计有3 000多种，不同品种资源梨化学成分和生物功效的遗传差异性尚缺乏系统研究，许多品种难以得到充分地利用。

植物多酚被称作人类健康的“第七营养素”，作为许多可食用植物生化和药理作用的主要贡献成分，具有抗癌、降糖、抗病毒、抗炎、治疗心血管疾病和阿茨海默症等多种有益于人体的生物活性[6-9]。人体自身不能合成多酚类化合物，因此需要通过外源性摄取，如苹果、梨、葡萄等水果，西红柿、茄子、黄瓜等蔬菜，玉米、大麦、豌豆等谷物，金银花、芍药、菊花等中草药以及各种相关加工品中均含有丰富的多酚化合物[10]。三萜酸类化合物也是一种广泛分布于植物中的重要次生代谢产物，具有很高的药用与经济价值，在芒果、大枣、葡萄等水果，卷心菜、青椒、魔芋等蔬菜，以及桑白皮、西洋参、芦荟等药用植物中均含有大量三萜酸成分[11]，具有抗炎、抗病毒、抗肿瘤、降血糖以及保护心脑血管等功效[12-14]。特别是以熊果酸和齐墩果酸等三萜酸为主要活性物质的枇杷叶更是临床上用于呼吸道炎症疾病的代表中药之一[15-16]。本实验室前期从多个梨品种的幼果中鉴定出102 个多酚（包括28 个酚酸类化合物，16 个酚苷类化合物，33 个黄酮类化合物，25 个黄烷-3-醇类化合物）和16 个三萜酸类物质[17]，果实成熟后，这些物质的含量变化、小分子活性物质是否存在品种特异性以及梨属果实中的特征性成分都还有待进一步研究。

因此，本研究以梨果实中的两大类化学活性成分——多酚和三萜酸为研究目标，根据近年来国内梨的种植和流通行情，从五大梨栽培品种（白梨、砂梨、秋子梨、西洋梨和新疆梨）和种间杂交选育品种中选择36 个代表性品种为试材，对梨成熟果实中的特征性生物活性物质展开系统研究，以期能够为梨果实后期各种功能性产品的加工选种提供一定参考，对于进一步挖掘利用梨种质资源，指导品种的培育与优选，规范相关功能产品的定向开发具有现实意义。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

36 个梨品种果实均为果园或种质基地直接采摘，详细信息见表1，每个品种选择3～6 棵长势良好的果树，待果实成熟期采摘，去除长相不良者。果实及时去皮去核，取果肉于液氮中切片，研磨粉碎，－80 ℃保存备用。

表1 梨试材果实样品信息Table 1 Information about ten pear varieties used in this study

续表1

对照品绿原酸、熊果苷、儿茶素、表儿茶素、新绿原酸、隐绿原酸、芦丁、齐墩果酸、熊果酸、咖啡酸和奎尼酸（纯度均大于98%） 中国食品药品检定研究所；木犀草苷、山柰酚-3-O-芸香糖苷、异鼠李素3-O-芸香糖苷、异绿原酸A、异绿原酸B、异绿原酸C、金丝桃苷（纯度均大于98%） 北京索莱宝科技有限公司；桦木酸、坡模酸、山楂酸、科罗索酸（纯度均大于98%）武汉生物化学公司；乙腈、甲醇（均为色谱纯） 德国Merck公司；甲酸、醋酸铵（均为色谱纯） 美国Aladdin公司；超纯水由美国Millipore公司仪器制备；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼、Trolox（均为分析纯）美国Sigma公司。

1.2 仪器与设备

LC-20AT超高效液相色谱系统（包括高压二元梯度泵、自动进样器、柱温箱、脱气机、二极管阵列检测器） 日本Shimadzu公司；AB Sciex Q TRAP 4000型三重四极杆线性离子阱杂交质谱仪（配备电喷雾离子源）、Analyst 1.6.3数据工作站 美国AB Sciex公司；AE-240十万分之一天平 美国梅特勒-托利多仪器有限公司；KH-400KDB高频率数控超声仪 昆山禾创超声仪器有限公司；UPLC HSS T3 C18色谱柱（2.1 mm×100 mm，1.8 μm） 美国Waters公司。

1.3 方法

1.3.1 样品溶液制备

梨果实供试品溶液的制备主要参考Sun Liqiong等[17]方法，略有改变，即精密称取－80 ℃保存的样品粉末2.0 g，加入25 mL的提取溶剂甲醇-水（80∶20，V/V），称质量，涡旋混合30 s，100 Hz超声提取30 min，每5 min搅拌1 次，每次30 s，取出，室温放置10 min，提取溶剂补足失质量，取上清液，12 000 r/min离心15 min，即得供试样品溶液。

精密称取各对照品适量置于5 mL容量瓶中，加甲醇溶液溶解制成对照品储备液。取各对照品储备液适量，加甲醇溶液定容至10 mL制成混合对照品溶液，并逐级稀释，得到一系列不同质量浓度的混合对照品溶液，12 000 r/min离心15 min，取上清液，备用。

1.3.2 超高效液相色谱测定条件

多酚类化合物：流动相A为乙腈，B为水（含0.1%甲酸），进行梯度洗脱：0～3 min，1%～15% A，99%～85% B；3～11 min，15%～40% A，85%～60% B；11～13 min，40% A，60% B；13～13.1 min，40%～1% A，60%～99% B；13.1～15 min，1% A，99% B。流速0.4 mL/min，柱温30 ℃，进样体积1 μL。

三萜酸类化合物：流动相为甲醇-水-醋酸铵（81∶19∶0.1，V/V）等度洗脱10 min，流速0.4 mL/min，柱温30 ℃，进样体积1 μL。

1.3.3 超高效液相色谱-串联质谱测定条件

采用超高效液相色谱-串联质谱（ultra-high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry，UPLC-MS/MS）的多离子反应监测模式对梨果中的多酚与三萜酸类化学成分进行定量分析。离子源为电喷雾离子源，检测方式为负离子检测，喷雾电压－4 500 V，雾化气温度500 ℃，气帘气30 psi，雾化气和辅助气为50 psi，对照品的其他扫描参数参照Sun Liqiong等[17]的方法。

1.4 数据处理分析

所有样品含量测定数据均为3 次平行测定后的平均值，以果实鲜质量（μg/g或μg/100 g）表示。以标准化的主要成分含量为变量，将数据导入SIMCA-P 14.1软件分别进行主成分分析（principal component analysis，PCA）和偏最小二乘-判别分析（partial least squaresdiscriminant analysis，PLS-DA），研究不同品种样品间的整体差异性。

2 结果与分析

尽管前期已有不少文献对成熟梨中的化学成分及含量有一定研究[18-19]，但研究的成分较少，且大多采用的是高效液相色谱-紫外检测方法，对待测成分色谱峰的分离要求较高，测定时间较长，而且检测灵敏度较差，特别是当提取物成分特别复杂时，难以排除极性类似、保留时间相近的化学成分干扰。另外，高效液相色谱-紫外检测对于紫外吸收很弱，且含量较低的三萜类物质往往难以测定。而本研究采用UPLC-MS/MS结合多离子反应监测模式，不仅克服了上述局限，保证了测定结果的准确性，还可以在短时间内得到大量的化学成分含量数据，对于紫外吸收较差的成分，如三萜酸等也有明显优势。通过对不同品种梨成熟果实中多酚和三萜酸类物质的含量测定分析，发现随着果实的生长发育，体积膨大，所检出的化合物含量和数量均有较大变化，且来源不同品种，特别是来源于不同系统的样品中物质种类和含量差异显著。

2.1 酚酸类化合物

酚酸是一类在梨和其他水果中普遍存在的代表性多酚类化合物。本实验在梨成熟果实中检测出29 种酚酸类化合物（编号为PA1～29），与幼果一致，成熟果中的多酚类物质主要来源于酚酸化合物[17]。如图1所示，对于不同品种系统的梨，秋子梨系统果实中总酚酸含量相对较高，特别是香水梨、南果梨和红南果总酚酸含量分别高达379.3、360.6、249.1 μg/g。此外，新疆梨系统的酸梨中酚酸物质含量为384.9 μg/g，也显著高于白梨、砂梨、西洋梨、杂交梨和其他新疆梨品种。在所检测的29 个酚酸化合物中，以奎尼酸（PA1）和绿原酸（PA6）含量较高，平均含量分别约占总酚酸的46.5%和47.2%，但两者在梨果中的含量均有较大的品种差异性。其中，奎尼酸在新疆梨系统的酸梨中含量最高，为176.0 μg/g，而在红茄梨样品中普遍含量较低，特别是在Tosca和红茄梨中仅约7.0 μg/g。绿原酸在秋子梨系统的香水梨和南果梨中含量最高，分别为249.7 μg/g和243.4 μg/g，但在大冬果、黄金梨、翠玉和黄酸梨样品中却未有检出。对所有样品中的酚酸化合物种类进行综合分析发现，奎尼酸（PA1）、肉桂酸异构体（PA2）、咖啡酰基色氨酸（PA3）、隐绿原酸（PA4）、绿原酸（PA6）、新绿原酸（PA7）、对香豆酰基奎尼酰基苹果酸酯（PA8）、1-O-咖啡酰基奎尼酸（PA9）、4-对香豆酰基奎尼酸（PA11）、羟基肉桂酸（PA17）、5-O-咖啡酰基奎尼酸甲酯（PA22）、异绿原酸A（PA25）和异绿原酸C（PA27）在大部分梨样品中普遍存在，可作为梨属果实的特征性酚酸成分。

图1 梨果实中的酚酸类化合物含量Fig. 1 Contents of 29 phenolic acids in pear fruits

图2 梨果实中的酚苷类化合物含量Fig. 2 Contents of 16 phenolic glycosides in pear fruits

成熟期的果实与幼果相比，大部分化合物的含量均显著降低数十倍，甚至上百倍，该变化规律与前期报道一致[20-21]，其中奎尼酸含量的下降指数显著高于绿原酸[17]。比如，秋子梨品种南果梨中的奎尼酸含量从幼果时期的10 500.5 μg/g降低到成熟时期的102.9 μg/g，绿原酸含量则从4 139.0 μg/g降低到243.4 μg/g，分别约下降102 倍和17 倍；白梨品种砀山酥梨中的奎尼酸含量从幼果时期的8 798.1 μg/g降低到成熟期的119.5 μg/g，绿原酸含量则从3 988.5 μg/g降低到74.4 μg/g，分别约下降74 倍和54 倍；新疆梨品种库尔勒香梨中的奎尼酸含量从幼果时期的6 725.8 μg/g降低到成熟期的43.3 μg/g，绿原酸含量则从1 207.7 μg/g降低到9.7 μg/g，分别约下降155 倍和124 倍；在西洋梨品种红茄梨中的奎尼酸含量从幼果时期的4 991.7 μg/g降低到成熟期的7.1 μg/g，绿原酸含量则从2 564.1 μg/g降低到70.6 μg/g，分别约下降703 倍和36 倍；在砂梨品种丰水梨中的奎尼酸含量从幼果时期的8 892.3 μg/g降低到成熟期的53.2 μg/g，绿原酸含量则从1 162.7 μg/g降低到8.8 μg/g，分别约下降167 倍和132 倍。苯丙烷代谢途径是植物中酚酸类次生代谢产物生物合成的主要途径。He Jingang等[21]以绿原酸为研究对象，采用雪花梨为试材，研究绿原酸及苯丙烷代谢途径中关键生物酶编码基因在果实生长发育全过程中的动态变化，发现随着果实的不断生长，这些相关编码基因的表达水平在果实细胞分裂期显著降低，至果实成熟阶段，均维持在极低表达水平。因此，成熟梨果中酚酸类化合物含量的降低与其生物代谢途径相关合成酶的低表达有着密切的关系。

2.2 酚苷类化合物

与前人报道一致，梨果中酚苷类化合物种类较少，其中熊果苷是最主要的酚苷类化合物[1,18]。熊果苷作为一种黑色素的天然抑制剂，被广泛用于高级增白化妆品的制作。研究发现梨是一种很好的熊果苷提取资源，其不仅在果皮、果肉中大量存在，在每年修剪丢弃的梨树枝中也含量丰富[22]。本实验在梨成熟果实中检测出16 种酚苷类化合物（编号PG1～16），如图2所示。与酚酸类化合物规律相似，对于不同品种系统样品，秋子梨系统果实中总酚苷含量整体相对较高，特别是香水梨、南果梨和红南果总酚酸含量分别高达188.6、241.6 μg/g和179.4 μg/g。而西洋梨系统果实中总酚苷含量普遍较低，均低于20 μg/g，特别是在Tosca中总酚苷仅含7.2 μg/g。该结果再次表明酚酸与酚苷在梨果中的生物合成途径存在着一定的相关性。熊果苷（PG1）占绝对优势，平均含量占总酚苷的94.4%，因此其品种特异规律与总酚苷基本一致，且亦与幼果期果实的品种特异规律一致。对所有样品中的酚苷化合物种类进行综合分析发现，熊果苷（PG1）、二氢咖啡酰基六糖苷I（PG2）、羟基苯丙酸六糖苷（PG3）、丁香酰基六糖苷I（PG4）、二氢咖啡酰基六糖苷II（PG5）、咖啡酰基六糖苷I（PG6）、长寿花糖苷（PG7）和香酰基六糖苷III（PG11）在大部分梨样品中普遍存在，可作为梨属果实的特征性酚苷成分。

图3 梨果实中的黄酮苷类化合物含量Fig. 3 Contents of 33 flavonoid glycosides in pear fruits

与幼果时期相比，梨果实成熟后，大部分酚苷化合物的含量均显著降低数十倍，甚至数百倍。比如，熊果苷在秋子梨品种南果梨成熟果中的含量从幼果时期的5 899.1 μg/g降低到241.6 μg/g，约24 倍；在白梨品种砀山酥梨成熟果中的含量从幼果时期的3 925.2 μg/g降低到15.5 μg/g，约253 倍；在新疆梨品种库尔勒香梨成熟果中的含量从幼果时期的3 007.4 μg/g降低到8.0 μg/g，约375 倍；在西洋梨品种红茄梨成熟果中的含量从幼果时期的3 511.6 μg/g降低到10.0 μg/g，约351 倍；在砂梨品种丰水梨成熟果中的含量从幼果时期的4 945.5 μg/g降低到9.5 μg/g，约520 倍。Cho等[20]以7 个砂梨栽培品种为试材，采用高效液相色谱-紫外检测法考察了熊果苷在果实发育周期的动态变化，发现在盛花期20 d梨幼果中熊果苷含量约465.3～983.8 mg/100 g，而在成熟后果实中含量约36.2～6.3 mg/100 g，整体变化趋势与本实验一致。但Cho等[20]所测定的熊果苷平均鲜果含量比本实验所测定数据略高，这不仅可能是由于具体的检测品种样品不同，还有可能是由于前者的实验对象是全果，而本实验所测定的是可食用的果肉部位。

2.3 黄酮类化合物

黄酮类化合物常常在梨的果皮部位被检出，而果肉中由于含量很低，往往难以检出[23-25]，而本实验所建立的方法在梨果中检测出33 种黄酮类化合物（编号FG1～33），表明本方法灵敏度较高。尽管其含量远低于酚酸和酚苷类化合物，但种类相当丰富，且不同品种间差异较大，即使是来源于同一系统，样品间的共性特征仍然较小。如图3所示，黄酮类物质生物合成途径关键作用酶在不同品种梨中遗传特性有很大差异。在白梨系统样品中，特征性化合物较少，仅异鼠李素-3-O-芸香糖苷（FG19）和异鼠李素-3-O-葡萄糖苷（FG24）2 种在所有样品中共存，总黄酮含量以郑州鹅梨最高，为119.7 μg/100 g，主要成分包括异鼠李素-3-O-芸香糖苷（FG19）、槲皮素乙酰化葡萄糖苷（FG21）、异鼠李素-3-O-葡萄糖苷（FG24）、异鼠李素乙酰化阿拉伯糖苷（F30），而其余白梨品种总黄酮含量普遍在30～40 μg/100 g之间，无显著差异。在砂梨系统中，样品间种类和含量差异很大，未检出共性成分，大部分样品中共性含有的化合物为芦丁（FG7）、金丝桃苷（FG8）、槲皮素乙酰化阿拉伯糖苷（FG16）和异鼠李素-3-O-葡萄糖苷（FG24），各样品以黄金梨总黄酮含量显著高于其他品种，为161.0 μg/100 g，山柰酚-3-O-芸香糖苷（FG15）为其黄酮优势化合物，而幸水总含量仅约3.2 μg/100 g，与黄金梨相差近50 倍。在西洋梨系统样品中，特征性化合物主要包括金丝桃苷（FG8）、槲皮素-3-O-葡萄糖苷（FG10）、异鼠李素-3-O-芸香糖苷（FG19）和异鼠李素-3-O-葡萄糖苷（FG24），该研究结果与Brahem等[23]的报道基本一致。其中，总黄酮含量以红蓓蕾砂样品最高，为127.1 μg/100 g，异鼠李素-3-O-葡萄糖苷（FG24）为其优势化合物，Tosca最低为37.2 μg/100 g，其余样品约在50～75 μg/100 g之间，无显著差异。在新疆梨系统样品中，异鼠李素-3-O-芸香糖苷（FG19）为特征性成分，同时芦丁（FG7）和异鼠李素-3-O-葡萄糖苷（FG24）在大部分样品中也有着较高含量，总黄酮含量以新梨七号和新疆酸梨样品较高，分别为151.0 μg/100 g和109.2 μg/100 g，库尔勒香梨样品最低为23.8 μg/100 g，其余样品约在55～70 μg/100 g之间，无显著差异。在秋子梨系统样品中，槲皮素-3-O-葡萄糖苷（FG10）、异鼠李素-3-O-芸香糖苷（FG19）和异鼠李素-3-O-葡萄糖苷（FG24）为特征性成分，其中以槲皮素-3-O-葡萄糖苷和异鼠李素-3-O-葡萄糖苷的含量普遍较高，特别是在香水梨中，同时芦丁（FG7）和异鼠李素乙酰化葡萄糖苷（FG31）在大部分样品中也普遍存在，总黄酮含量在香水梨中最高，为128.9 μg/100 g，其余样品约在63～77 μg/100 g之间，无显著差异。在杂交梨品种中，尽管不同样品来源父本和母本差异较大，但异鼠李素-3-O-芸香糖苷（FG19）和异鼠李素-3-O-葡萄糖苷（FG24）在所有样品中共性存在，且含量较高，同时芦丁（FG10）、槲皮素-3-O-葡萄糖苷（FG10）、槲皮素乙酰化阿拉伯糖苷（FG16）和山柰酚-3-O-芸香糖苷（FG15）也在大部分样品中有较高含量，总黄酮含量在桔蜜中最高，为150.3 μg/100 g，其中山柰酚-3-O-芸香糖苷（FG15）为其优势黄酮化合物，其余样品总含量较低，均在20～40之间，无显著差异。综合分析，异鼠李素-3-O-芸香糖苷（FG19）和异鼠李素-3-O-葡萄糖苷（FG24）在梨样品中普遍存在，且均有较高含量，同时芦丁（FG7）、槲皮素乙酰化阿拉伯糖苷（FG16）和异鼠李素乙酰化葡萄糖苷（FG31）在大部分梨样品中也均有检出，这些化合物可以作为梨属果实的代表性黄酮成分。

图4 梨果实中的黄烷-3-醇和原花青素类化合物含量Fig. 4 Contents of 25 flavan-3-ols and procyanidins in pear fruits

图5 梨果实中的三萜酸类化合物含量Fig. 5 Contents of16 triterpenoids in pear fruits

与幼果时期相比，梨果实在成熟过程中，黄酮化合物含量降低程度比酚酸和酚苷更为显著。比如，总黄酮在秋子梨品种南果梨成熟果中的含量从幼果时期的259.0 μg/g降低到76.6 μg/100 g，约338 倍；在白梨品种砀山酥梨成熟果中的含量从幼果时期的380.9 μg/g降低到39.6 μg/100 g，约962 倍；在新疆梨品种库尔勒香梨成熟果中的含量从幼果时期的266.9 μg/g降低到23.8 μg/100 g，约1 121 倍；在西洋梨品种红茄梨成熟果中的含量从幼果时期的478.1 μg/g降低到49.5 μg/100 g，约966 倍；在砂梨品种丰水梨成熟果中的含量从幼果时期的147.3 μg/g降低到39.5 μg/100 g，约373 倍。Cho等[20]通过紫外分光光度法观察总黄酮含量在砂梨果实发育周期的动态变化，发现在盛花期前50 d内，即果实细胞分裂期，总黄酮含量呈直线式显著降低，至果实发育后期，下降趋势逐渐平缓。

2.4 黄烷-3-醇和原花青素类化合物

黄烷-3-醇类化合物主要以表儿茶素、儿茶素以及二者聚合形成的原花青素为代表，在梨果中普遍存在，特别是在西洋梨中报道较多，而且主要存在于梨皮部位[25-26]。本实验在梨成熟果实中检测出25 种黄烷-3-醇和原花青素类化合物（编号FA1～25），但其平均总含量显著低于酚酸和酚苷类化合物，如图4所示。其中，以西洋梨系统中红茄梨、三季梨以及早金香梨样品的总黄烷-3-醇含量较高，分别为26.3、17.5 μg/g和12.5 μg/g，其次白梨系统的六月酥、新疆梨系统的康乐酥木梨、秋子梨系统的南果梨和黄香水、杂交系统的华酥样品中也含有较高含量的总黄烷-3-醇，分别为14.2、15.0、14.3、15.4 μg/g和13.9 μg/g。而在检测的所有砂梨样品中黄烷-3-醇类化合物含量均较低，总含量低于1.7 μg/g。在所检测的25 个黄烷-3-醇类化合物中，以表儿茶素（FA8）和B型原花青素二聚体II（FA5）含量较高，平均含量分别约占总黄烷-3-醇类的44.7%和23.6%。对所有样品中的黄烷-3-醇和原花青素类化合物进行综合分析发现，儿茶素（FA3）、B型原花青素二聚体II（FA5）、表儿茶素（FA8）、B型原花青素三聚体III（FA12）和B型原花青素四聚体（FA15）在大部分梨样品中普遍存在，可作为梨属果实的特征性黄烷-3-醇和原花青素类成分。

与幼果时期相比，梨果实在成熟过程中，黄烷-3-醇化合物含量随着果肉的增长膨大亦显著降低，但下降指数明显低于黄酮类化合物，约十倍至百倍。总黄烷-3-醇在秋子梨品种南果梨成熟果中的含量从幼果时期的186.3 μg/g降低到14.3 μg/g，约13 倍；在白梨品种砀山酥梨成熟果中的含量从幼果时期的63.5 μg/g降低到0.5 μg/g，约127 倍；在新疆梨品种库尔勒香梨成熟果中的含量从幼果时期的52.3 μg/g降低到0.2 μg/g，约261 倍；在西洋梨品种红茄梨成熟果中的含量从幼果时期的711.7 μg/g降低到26.3 μg/g，约27 倍；在砂梨品种丰水梨成熟果中的含量从幼果时期的163.8 μg/g降低到1.0 μg/g，约164 倍。

2.5 三萜酸类化合物

梨成熟果中含有丰富的三萜酸类物质（TA），尽管其含量不及酚酸和酚苷类化合物，但由于具有优越的抗肿瘤、抗炎等药效活性，在许多功能性果蔬中也广泛受到关注。如图5所示，梨果中检测出16 种三萜酸类化合物（编号TA1～16），除经常报道的白桦酸脂（TA14）、齐墩果酸（TA15）和熊果酸（TA16）外[1,27]，主要成分还包括委陵菜酸（TA2）、anmurcoic acid（TA3）、山楂酸（TA10）和科罗索酸（TA11）。不同品种样品进行对比发现三萜酸类物质在不同品种梨果实中含量区间跨度很大，在所检测的36 份样品中，黄香水梨的总三萜酸含量最高，约680.6 μg/100 g，而在西洋梨品种早金香和Tosca中含量最低，分别为5.1 μg/100 g和5.6 μg/100 g，相差120多倍。来源于西洋梨、砂梨、新疆梨和杂交品种的样品中，各三萜酸化合物含量普遍较低。对所有样品中的三萜酸类化合物进行综合分析发现，蔷薇酸（TA1）、委陵菜酸（TA2）、anmurcoic acid（TA3）、坡模酸异构体（TA4）、麦珠子酸（TA9）、山楂酸（TA10）、科罗索酸（TA11）、白桦酸脂（TA14）、齐墩果酸（TA15）和熊果酸（TA16）在大部分梨样品中普遍存在，可作为梨属果实的特征性三萜类成分。

与幼果时期相比，成熟后梨果实中的三萜酸化合物含量降低约百倍至数千倍。总三萜酸在秋子梨品种南果梨成熟果中的含量从幼果时期的274.6 μg/g降低到178.1 μg/100 g，约154 倍；在白梨品种砀山酥梨成熟果中的含量从幼果时期的305.7 μg/g降低到22.8 μg/100 g，约1 300 倍；在新疆梨品种库尔勒香梨成熟果中的含量从幼果时期的227.5 μg/g降低到15.7 μg/100 g，约1 449 倍；在西洋梨品种红茄梨成熟果中的含量从幼果时期的193.0 μg/g降低到8.7 μg/100 g，约2 218 倍；在砂梨品种丰水梨成熟果中的含量从幼果时期的297.4 μg/g降低到6.5 μg/100 g，约4 575 倍。

2.6 PCA和PLS-DA

将梨果实中的酚酸、酚苷、黄酮、黄烷3-醇和三萜酸化合物的含量标准化后，导入SIMCA-P软件中，分别进行无监督模式识别的PCA和有监督督模式识别的PLSDA[28]。如图6所示，大部分来源于相同品种系统的梨样品，如砂梨和西洋梨，在PCA和PLS-DA得分图上整体分布较近，没有明显分界，表明差异相对较小。但是在PLSDA得分图上，白梨系统的硕丰和六月酥（编号4和6）以及新疆梨系统的新疆酸梨（编号23）与其他样品差异较大，表明品种特异性较强。其中，硕丰和六月酥的三萜酸，如科罗索酸、熊果酸、山楂酸和委陵菜酸等，含量较高，而且六月酥中还含有较高的表儿茶素和原花青素二聚体。新疆酸梨中绿原酸和奎尼酸含量也远高于其他新疆梨样品。另外，大部分秋子梨品种样品与其他品种差异较大，可以明显分开，如南果梨、香水梨、伏香和黄香水（编号27、28、29和31）。这可能是由于秋子梨中的酚酸、酚苷和三萜酸等含量普遍较高。而且秋子梨系统内部不同品种样品的PCA和PLS-DA得分图分布也相对分散，特别是南果梨的芽变品种红南果（编号30）与南果梨（编号27）样品在得分图上分布较远，两者差异明显，表明该系统样品具有较强的品种特异性。

图636 个梨品种果实的PCA（a）和PLS-DA（b）结果Fig. 6 Score plots of PCA (a) and PLS-DA (b) for pear fruits of 36 cultivars

3 结 论

我国梨品种资源丰富，多年来在抗氧化、抗炎、抗溃疡等方面都有着广泛的临床应用，使其在保健品及药品方面的开发前景广阔。本研究采用UPLC-MS/MS的多离子反应监测模式，从五大传统梨系统和杂交梨品种中，选择36 种常见品种为试材，对成熟梨果实展开靶向性代谢组学研究，结果发现成熟梨果实中含有丰富的多酚和三萜酸类物质。PCA和PLS-DA表明，虽然不同样品所含的化合物种类和含量都存在一定的差异，但是许多品种间的整体差异分界并不明显。除此之外，秋子梨系统的样品品种特异性较强，与其他品种样品普遍差异较大。将幼果期和成熟期的样品进行对比分析发现，在成熟过程中，梨果中的许多多酚和三萜小分子活性化合物含量显著降低数十倍甚至上千倍，其中以南果梨为代表的秋子梨品种果实含量降低指数显著小于其他品种。再进一步通过对所有样品中化合物种类展开系统分析，有40 个化合物，包括12 个酚酸、8 个酚苷、5 个黄酮苷、5 个黄烷-3-醇以及10 个三萜酸，在大部分测定梨品种中普遍存在，这些物质可以初步确定为评价梨属果实的特征性多酚和三萜酸类物质。该研究结果对于进一步完善梨果实的质量评价体系具有重要意义，同时也可为规范化梨后期产业链功能性产品的选种加工提供一定的参考。