植物乳杆菌还原形成不同粒径纳米硒的培养条件及其生物活性分析

张羽竹，王冰宜，曾梓敖，徐若芸，李 军，樊明涛,，魏新元,

（1.西北农林科技大学食品科学与工程学院，陕西 杨凌 712100；2.西北农林科技大学生命科学学院，陕西 杨凌 712100）

硒是机体正常生命活动所必需的微量元素，在维持氧化还原平衡[1]、免疫调节[2]、拮抗重金属[3]、抑制癌症[4]、保护DNA和染色体免受氧化损伤[5]等方面发挥着重要作用。硒主要以无机化合态硒、有机硒及无机单质硒形式存在，能以一种或者多种形态进入生物体。不同形态的硒，其毒性存在差异，其中无机化合态硒毒性最高，其次为有机态硒，单质硒毒性最弱。单质纳米硒因其低细胞毒性和高生物学活性受到了人们的广泛关注[6-9]。

目前，纳米硒的合成方法主要有3 种，分别为物理法[10-11]、化学法[12-13]以及生物法[14-16]。物理、化学法合成的纳米硒，不仅价格昂贵，而且存在不安全因素如刺激性的化学物质，因此，应用受到限制[17]。而生物法合成的纳米硒，由于经过生物体的转化，不仅大大减少了其对机体的毒性，而且能更方便被机体吸收和利用，更好地发挥硒的生物学功能。研究发现，许多微生物具有还原亚硒酸钠合成纳米硒的功能[18-28]。

乳酸菌为一类常见的食品发酵微生物，其安全性和益生性已得到广泛认可，许多乳酸菌被报道具有生物合成纳米硒的功能。Radhika Rajasree等[22]利用嗜酸乳杆菌、植物乳杆菌和鼠李糖乳杆菌将硒离子还原为纳米硒。Yang Jingpeng等[23]利用保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌制备富硒乳酸菌时，发现细胞周围存在纳米硒。Xu Chunlan等[24]发现，干酪乳杆菌393在厌氧条件下能将亚硒酸钠转化为纳米硒。此外，发酵乳杆菌[25]、罗伊氏乳杆菌[26]、短乳杆菌[27]以及布氏乳杆菌[28]等也具有将无机硒还原成纳米硒的能力。因此，由于其益生性，乳酸菌可作为合成生物源纳米硒的良好载体和转化体，作为食品添加剂进行补硒。

纳米颗粒的粒径与其生物学活性具有相关性。研究发现[29]，当大多数纳米化学物质的粒径减小时，其化学、物理和生物学性质会发生改变。Qi Lifeng等[30]研究发现，壳聚糖纳米颗粒的粒径越小，对肿瘤细胞的抑制作用越强。Huang Bo等[31]用化学合成法制得不同粒径的纳米硒，并发现纳米硒对1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picryhydrazyl，DPPH）自由基、超氧阴离子自由基、单态氧和一氧化氮自由基的清除效率与粒径有关，粒径越小，清除效率越高。还有研究表明，纳米硒对于谷胱甘肽转移酶活性的影响具有粒径效应[32]。

为探究基本培养条件对乳酸菌纳米硒粒径形成的影响，并分析不同粒径纳米硒颗粒的生物学活性差异，本研究选用常见的益生乳酸菌——植物乳杆菌作为实验菌株，分析培养条件对纳米硒粒径的影响，并在此基础上探究其粒径与体外抑菌活性和抗氧化活性的相关性。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 菌株

本实验室保存的植物乳杆菌13 株，编号分别为WZ1、WZ2、WZ3、WZ4、WZ5、WZ6、WZ7、WZ8、WZ9、WZ10、WZ11、WZ12、WZ13。

1.1.2 培养基

MRS液体培养基：酵母浸粉4 g、葡萄糖20 g、乙酸钠5 g、牛肉膏5 g、蛋白胨10 g、柠檬酸三铵2 g、磷酸氢二钾2 g、吐温-80 1 mL、MgSO4·7H2O 0.1 g、MnSO4·H2O 0.05 g、蒸馏水1 000 mL。

改良MRS固体培养基：1 000 mL MRS液体培养基中加入碳酸钙10 g、琼脂15～20 g。

LB液体培养基：胰蛋白胨10 g、酵母菌粉5 g、氯化钠10 g、蒸馏水1 000 mL。

LB固体培养基：1 000 mL LB液体培养基中加入琼脂粉15～20 g。

1.1.3 试剂

亚硒酸钠、3,3’-二氨基联苯胺（3,3’-diaminobenzidine，DAB）、乙二胺四乙酸二钠（ethylenediamine tetraacetic acid disodium salt，EDTA-2Na）、硝酸、高氯酸、盐酸、无水乙醇、0.2 mmol/L DPPH、2,2’-联氮双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)（2,2’-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)，ABTS）、磷酸盐缓冲液（pH 6.6，0.2 mol/L）、铁氰化钾、三氯乙酸、三氯化铁等。

1.2 仪器与设备

ZEN3600纳米激光粒度仪 英国Malvern Instruments Limited公司；HS-840μ型水平层流单人净化工作台苏州净化设备有限公司；HC-3018R高速冷冻离心机安徽中科中佳科学仪器有限公司；UVmini-1240紫外分光光度计 日本岛津公司；pH计 上海精密科学仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 富硒植物乳杆菌的筛选

将13 株植物乳杆菌活化后分别制成种子液（OD600nm为0.8左右），按2%（V/V）接种量接入亚硒酸钠质量浓度为10 μg/mL的MRS培养液中，35 ℃培养24 h，观察菌株的生长情况，选择生长旺盛的菌株进行下一步研究。

1.3.2 亚硒酸钠质量浓度对植物乳杆菌生长的影响

将初步选择的菌株培养至对数期，分别按2%接种量接入不同亚硒酸钠质量浓度的MRS培养液中（分别为0、20、40、60、80、100、120 μg/mL），35 ℃培养至稳定期后，各取1 mL发酵液，采用10 倍系列稀释后涂布，35 ℃培养至菌落清晰可见，通过平皿计数法确定活菌数。

1.3.3 适宜亚硒酸钠质量浓度的确定

乳酸菌能还原亚硒酸钠生成单质硒，不同生成量的单质硒可使菌体呈现不同程度的红色，生成单质硒越多，菌体沉淀所显示的红色越深，因此，可以通过沉淀颜色确定适宜的亚硒酸钠质量浓度[33-34]。将初步选择的菌株培养至对数期，按2%接种量接入含不同质量浓度亚硒酸钠（分别为0、20、40、60、80、100、120 μg/mL）的MRS培养液试管中，35 ℃培养24 h，观察试管中菌体沉淀颜色，确定适宜的亚硒酸钠质量浓度。

1.3.4 培养条件对纳米硒粒径以及硒含量的影响

通过单因素试验分析培养液初始pH值、温度、接种量、亚硒酸钠质量浓度以及胁迫时间对纳米硒粒径以及硒含量的影响。初始pH值的影响：设置温度35 ℃、接种量2%、亚硒酸钠质量浓度80 μg/mL、胁迫时间5 h，培养液初始pH值为4.0、6.8和8.0分别进行单因素试验；温度的影响：设置初始pH 6.8、接种量2%、亚硒酸钠质量浓度80 μg/mL、胁迫时间5 h，温度为25、35 ℃和45 ℃分别进行单因素试验；接种量的影响：设置初始pH 6.8、温度35 ℃、亚硒酸钠质量浓度80 μg/mL、胁迫时间5 h，接种量为1%、2%和4%分别进行单因素试验；亚硒酸钠质量浓度的影响：设置初始pH 6.8、温度35 ℃、接种量2%、胁迫时间5 h，亚硒酸钠质量浓度为60、80 μg/mL和100 μg/mL分别进行单因素试验；胁迫时间的影响：设置初始pH 6.8、温度35 ℃、接种量2%、亚硒酸钠质量浓度80 μg/mL，胁迫时间为5、12 h和19 h分别进行单因素试验。

1.3.5 纳米硒颗粒的制备与粒径测定

1.3.6 纳米硒颗粒硒含量的测定

采用混合酸消化法[36]处理纳米硒颗粒，并进行一定改进。精确称取0.500 g硒颗粒，加10 mL硝酸-高氯酸混合酸（9∶1），冷消化过夜。置于沸水浴中加热，并及时补加硝酸。当溶液变为清亮无色并伴有白烟产生时，再继续加热至剩余体积为2 mL左右。冷却，再加5 mL 6 mol/L盐酸溶液，继续加热至溶液变为清亮无色并伴有白烟出现。将溶液准确稀释至100 mL，取20 mL加蒸馏水至35 mL作为反应样。

采用DAB比色法[37]测定纳米硒颗粒中的硒含量，根据测定的OD值，通过标准曲线得到纳米颗粒的硒含量。

1.3.7 不同粒径纳米硒颗粒生物活性的分析

1.3.7.1 纳米硒颗粒的选择

为分析不同粒径纳米硒颗粒的生物学活性，根据制得纳米硒粒径，参考连续性变数资料整理方法[38]进行分组，从中选择几种具有差异性的硒纳米颗粒，在调整最终硒质量浓度一致的条件下，分别对不同粒径纳米硒的体外抑菌活性和抗氧化活性进行分析。

1.3.7.2 抑菌活性

鸡群突然出现发病症状，由于鸡群日龄较小，养殖户并没有考虑鸡传染性法氏囊病。出现发病症状后，患病鸡表现为精神萎靡不振，进食量逐渐下降，双翅下垂，羽毛杂乱，多只患病鸡拥挤扎堆。患病鸡临床症状主要表现为腹泻，大部分患病鸡腹泻物为黄色粥样稀便，之后粪便逐渐变成白色，呈水样经过，由于腹泻严重，患病鸡后躯之体被腹泻物严重污染，严重导致泄殖腔堵塞。腹泻时间延长，患病鸡身体出现明显脱水症状，全身皮肤干燥，眼窝向内凹陷，最终衰竭死亡

为确定不同纳米硒粒径与抑菌活性的相关性，将不同粒径的纳米硒颗粒分别与4 种常见的食源性致病菌鼠伤寒沙门氏菌（Salmonella typhimurium）、金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、大肠杆菌（Escherichia coli）以及单核细胞性李斯特菌（Listeria monocytogenes）进行共同培养，通过测定实验菌株经过一定胁迫时间后菌悬液在600 nm波长处OD值评价其抑菌性能。

具体为：将实验菌菌液以2%接种量接入LB培养液中培养至对数后期，然后稀释成107CFU/mL的菌液，分别加入到含不同粒径纳米硒颗粒（最终硒质量浓度一致）的LB试管中作为处理组，同时以加入对应体积生理盐水设置对照组，35 ℃恒温培养。于0、3、6、9、12、15 h取样，于600 nm波长处测定菌液OD值。

1.3.7.3 抗氧化活性

分别称取不同粒径的纳米硒颗粒溶于10 mL蒸馏水，制成最终硒质量浓度一致的纳米硒溶液，待用。DPPH自由基清除率的测定参照杨靖鹏等[39]的方法，ABTS阳离子自由基清除率的测定参照Wootton等[40]的方法，总还原力的测定参照Lin等[41]的方法。

羟自由基的测定参照Li Shengyu等[42]的方法进行一定修改。分别吸取9 mmol/L FeSO4、9 mmol/L 水杨酸-乙醇溶液和1 mL纳米硒溶液于试管中，加入1 mL 9 mmol/L H2O2溶液混匀后，37 ℃水浴30 min，于510 nm波长处测定各溶液的吸光度A1。以等体积蒸馏水代替H2O2作为本底组，测定其吸光度A2，以等体积乙醇代替纳米硒溶液作为空白组，测定其吸光度A0。按下式计算清除率：

1.4 数据分析

运用Minitab 18进行数据处理与显著性分析。

2 结果与分析

2.1 富硒植物乳杆菌的筛选结果

表1 13 株植物乳杆菌在含10 μg/mL亚硒酸钠MRS培养液中的生长情况Table 1 Growth rates of 13 strains of L. plantarum in MRS medium containing 10 μg/mL Na2SeO3

如表1所示，菌株WZ1、WZ2、WZ3、WZ7、WZ8、WZ9、WZ10和WZ11均能在含硒培养液中生长，其中WZ1、WZ2、WZ8生长旺盛，因此选取该3 株菌进行进一步研究。

2.2 亚硒酸钠质量浓度对植物乳杆菌生长的影响

表2 亚硒酸钠质量浓度对植物乳杆菌生长的影响Table 2 ffect of different concentrations of sodium selenite on L. plantarum growth

表2 亚硒酸钠质量浓度对植物乳杆菌生长的影响Table 2 ffect of different concentrations of sodium selenite on L. plantarum growth

亚硒酸钠质量浓度/（μg/mL）1.48±0.19 1.31±0.24 1.92±0.18 20 1.37±0.16 1.35±0.11 1.90±0.13 40 1.32±0.13 1.34±0.18 1.93±0.22 60 1.36±0.21 1.38±0.12 1.93±0.11 80 1.53±0.12 1.39±0.13 1.98±0.15 100 1.34±0.18 1.26±0.21 1.89±0.32 120 1.23±0.13 1.24±0.17 1.78±0.30菌落数/（108 CFU/mL）WZ1 WZ2 WZ8 0

由表2可以看出，当亚硒酸钠质量浓度不高于80 μg/mL时，3 株植物乳杆菌生长状况受硒的影响较少，其中WZ8生长状况最好；在亚硒酸钠质量浓度为80 μg/mL时，菌落数均达到了峰值，WZ1为（1.53±0.12）×108CFU/mL，WZ2为（1.39±0.13）×108CFU/mL，WZ8为（1.98±0.15）×108CFU/mL。

2.3 适宜亚硒酸钠质量浓度的确定

表3 不同质量浓度亚硒酸钠下菌体沉淀的颜色变化Table 3 Color of bacterial cell precipitates at different concentrations of Na2SeO3

如表3所示，菌体沉淀颜色与亚硒酸钠质量浓度呈正相关：随着亚硒酸钠质量浓度增加，菌体沉淀颜色逐渐变浓。有研究[43]表明，乳酸菌将富集的一部分硒转化为有机硒，用于生命活动，而另一部分则转化为零价态的单质硒，单质硒的存在使菌体沉淀呈现红色。随着亚硒酸钠质量浓度的增加，菌株的富硒量会随之增加，菌株的生物量则会减少[44]。但从益生效果以及机体吸收利用的角度考虑，应在保证菌株生物量的前提下获得较多的单质硒，故选择菌体沉淀为粉色时的浓度较为适宜。从菌体沉淀的颜色变化中选择使其呈现粉色对应的为亚硒酸钠适宜质量浓度，即WZ1、WZ2、WZ8适宜的亚硒酸钠质量浓度均为80 μg/mL。因此，结合表2与表3，选择WZ8为实验菌株，亚硒酸钠质量浓度为80 μg/mL进行下一步研究。

2.4 培养条件对纳米硒粒径及其硒含量的影响

表4 培养条件对纳米硒粒径以及硒含量的影响Table 4 ffects of different culture conditions on the size and selenium content of nanoparticles

表4 培养条件对纳米硒粒径以及硒含量的影响Table 4 ffects of different culture conditions on the size and selenium content of nanoparticles

注：表中数值均为，同一因素同列字母不同表示差异显著（P＜0.05）。

因素 编号 水平 粒径/nm 硒质量分数/%初始pH A1 4.0 322.23±83.88a 0.277±0.002d A2 6.8 239.20±41.29a 0.230±0.004e A3 8.0 481.76±33.78b 0.406±0.002f温度/℃B1 25 442.07±42.23a 0.262±0.002d B2 35 477.20±43.60a 0.421±0.001e B3 45 844.97±15.43b 0.157±0.001f接种量/%C1 1 298.00±86.78a 0.422±0.003d C2 2 743.33±50.50b 0.643±0.023e C3 4 141.26±29.62c 0.527±0.002f亚硒酸钠质量浓度/（μg/mL）D1 60 137.93±68.97a 0.446±0.002d D2 80 206.90±34.49ab 0.513±0.009e D3 100 270.27±35.14b 0.670±0.004f E1 5 180.18±52.50a 0.128±0.014d E2 12 423.07±4.55b 1.062±0.050e E3 19 458.63±67.15b 0.618±0.013f胁迫时间/h

如表4所示，pH 4.0和pH 6.8条件下产生的纳米硒粒径之间不存在显著性差异，但它们均与pH 8.0条件下的纳米硒粒径之间存在显著性差异。当起始pH值为8.0时，纳米硒粒径最大；起始pH值为6.8时，粒径最小。纳米硒颗粒的硒含量随着培养液起始pH值变化而改变，两两之间存在显著差异。

植物乳杆菌WZ8在25 ℃和35 ℃条件下还原亚硒酸钠形成硒颗粒，粒径无显著差异，二者与45 ℃条件下形成的粒径之间存在显著差异。45 ℃形成的纳米硒粒径几乎是另外两种温度条件下的2 倍。不同培养温度下，纳米硒颗粒的硒含量之间存在显著差异，其中35 ℃条件下的纳米颗粒中硒含量最高。

3 种接种量形成的纳米硒，其粒径以及硒含量两两之间均具有显著差异；当接种量为2%时得到纳米硒粒径最大，接种量为4%时则最小；当接种量为2%时，纳米颗粒硒含量最高，接种量为1%时最低。

只有60 μg/mL和100 μg/mL亚硒酸钠质量浓度下形成的纳米硒粒径之间存在显著性差异；而不同亚硒酸钠质量浓度下形成的纳米颗粒硒含量之间均具有显著差异，随着培养体系中的亚硒酸钠质量浓度增加，纳米硒粒径增大，其颗粒中的硒含量也随之增加。

胁迫12 h和19 h形成的纳米硒粒径之间无显著差异，但均与胁迫5 h之间存在显著性差异，其中胁迫19 h的粒径最大，胁迫5 h的粒径最小。不同胁迫时间下，WZ8还原形成纳米颗粒的硒含量间均具有显著差异，胁迫12 h的硒含量最高。

综上，植物乳杆菌WZ8在还原形成纳米硒颗粒时，颗粒的粒径及其硒含量均受到培养条件的影响。其中菌株的接种量对纳米硒粒径影响最大；而当培养温度、亚硒酸钠质量浓度以及胁迫时间改变时，纳米硒粒径的变化呈现出一定的规律性：随着培养温度的升高、亚硒酸钠质量浓度增加以及胁迫时间的延长，纳米硒粒径增大。而不同培养条件下形成的纳米颗粒的硒含量各不相同，各因素不同水平之间，颗粒中的硒含量两两间均存在显著差异。

2.5 纳米硒颗粒的选择

参考连续性变数资料整理方法[38]，根据制得纳米硒粒径，将其分为5 组，如表5所示。结合纳米硒粒径分布及其差异显著性，分别从各组中选择一份样品，编号为（按粒径从小到大排列）E1、D3、E2、C2（粒径分布如图1所示）。在控制培养体系最终硒含量一致的条件下，对它们的体外抑菌性以及抗氧化性进行了测定。

表5 不同粒径纳米硒颗粒的分组Table 5 Grouping of selenium nanoparticles with different sizes

图1 为所选择的几种代表性纳米硒的粒径分布。样品E1粒径分布约为74～238 nm，平均粒径为（180.18±52.50）nm；样品D3粒径分布约为43～295 nm，平均粒径为（270.27±35.14）nm，样品E2粒径分布约为164～439 nm，平均粒径为（423.07±4.55）nm；样品C2粒径分布约为288～778 nm，平均粒径为（743.33±50.50）nm。

图1 4 种纳米硒粒径分布Fig. 1 Size distribution of four selenium nanoparticles

2.6 不同粒径纳米硒颗粒生物学活性分析

2.6.1 抑菌活性

图2 不同粒径纳米硒颗粒的抑菌活性Fig. 2 Antimicrobial activities of selenium nanoparticles with different sizes

如图2所示，不同粒径纳米硒颗粒对鼠伤寒沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌以及单核细胞性李斯特菌的抑制作用相似，均为E1＞D3＞E2＞C2。结合纳米硒粒径可知，纳米硒粒径越小，其对4 种指示菌的抑制作用越明显。

2.6.2 抗氧化活性

图3 不同粒径纳米硒颗粒的抗氧化活性Fig. 3 Antioxidant activities of selenium nanoparticles with different sizes

不同粒径的纳米硒颗粒，其清除自由基的能力以及总还原力不同（图3）。4 种纳米硒颗粒清除ABTS阳离子自由基和羟自由基的能力，两两之间存在显著差异，其中E1对ABTS阳离子自由基清除能力最强，E2则对羟自由基清除能力最强。由纳米硒的DPPH自由基清除率可知，除E2、C2外，其余两两间存在显著差异，其中E1的DPPH自由基清除率约为E2或C2的3 倍；另外，除D3与C2、E2与C2外，其余两两间的总还原力存在显著差异。综上，纳米硒的抗氧化活性与其粒径存在一定的相关性。

3 讨论与结论

研究结果表明，培养液起始pH值、培养温度、接种量、亚硒酸钠质量浓度以及胁迫时间等均会影响植物乳杆菌WZ8还原形成的纳米硒粒径。体外抑菌实验的结果表明，不同粒径纳米硒颗粒对4 种食源性致病菌的抑制作用不同，粒径较小的纳米硒颗粒对同一致病菌的抑制作用较强。这与Pal等[45]的研究结果一致。其原因可能是当接触的表面积一定时，粒径较小的纳米硒颗粒在细菌细胞上的结合位点更多，故对细菌生长的抑制作用更强。抗氧化活性实验发现，不同粒径的纳米硒颗粒的总还原力及其对自由基的清除力存在差异，相较于粒径较大的纳米硒颗粒，粒径较小的颗粒对自由基的清除力以及总还原力较强。此结果与Huang Bo等[31]报道一致。其原因可能是纳米硒粒径越小，用于与自由基电子交换的原子越多，对自由基的清除效率就越高。但不同粒径纳米硒的羟自由基清除率呈现波动，可能是由纳米颗粒表层聚合物所引起。本研究纳米粒径粒径尚未直接反映颗粒硒含量的高低，可能是由于纳米颗粒表面聚合物层的成分或含量存在差异所致。

本实验研究了培养条件对纳米硒粒径的影响，以及不同粒径纳米硒的体外抑菌活性、抗氧化活性与粒径之间的相关性，并结合不同培养条件下粒径的差异显著性和菌株生长条件，得到最佳获得高生物学活性纳米硒颗粒的培养条件为：起始pH 6.8、培养温度35 ℃、接种量4%、亚硒酸钠质量浓度80 μg/mL、胁迫时间5 h。但培养条件对纳米硒粒径影响的作用机理尚不明确，仍需进一步的研究和探索。