大肠杆菌O157:H7在不锈钢表面生物膜形成能力及其与菌株的特性关系

吴丽娜，董鹏程，张一敏，毛衍伟，梁荣蓉，杨啸吟，朱立贤,，罗 欣,2

（1.山东农业大学食品科学与工程学院，山东 泰安 271018；2.江苏省肉类生产与加工质量安全控制协同创新中心，江苏 南京 210095）

大肠杆菌O157:H7是一种食源性致病菌，可引起人感染性腹泻、出血性结肠炎和溶血性尿毒综合征等疾病，严重时可致人死亡[1]。食品可以作为大肠杆菌O157:H7污染的爆发源，例如鱼、牛肉、乳品、水果等都可以作为大肠杆菌O157:H7的载体[2-4]。生物膜是指微生物为了适应环境，黏附于非生物或活性组织表面，分泌大量的多糖、蛋白质和核酸等不均一的胞外基质，将菌体自身包裹在其中而形成的大量菌体聚集膜状物，是菌体在自然界中常见的生存状态，直接影响着人类生产和生活的各个方面[5]。大肠杆菌O157:H7常通过形成生物膜附着在食品、食品加工设备、包装材料等表面，难以杀灭与清除，从而形成持续性的污染，产生食品安全隐患，造成巨大的经济损失，并且增加了食源性疾病爆发的风险[6]。

在接触面上生物膜的形成是一个复杂的动态过程，受到很多因素的影响，比如细菌分离的来源、接触面的类型、菌株特性（自聚性、运动性、疏水性）等。大多数学者都是在实验室标准培养基中研究细菌的生物膜形成，如胰蛋白胨大豆肉汤、LB培养基等[7-8]，但是不同的营养条件都会对生物膜的形成产生影响。食品加工中的一些条件，如接触面的类型、营养基质等都与实验室的条件有所不同，因此，与在实验室条件下评估的生物膜相比，真实的食品加工环境中的生物膜可能出现不同的生长情况。肉汁培养基可被用于在实验室中模拟真实情况的培养环境，有学者研究发现鸡肉汁培养基对弯曲杆菌和沙门氏菌生物膜的形成有着促进作用[9]。还有一些含有食物成分（如鱼、牛奶、油和碳水化合物）的培养基也可以对大肠杆菌生物膜起着保护作用[10]。但也有研究发现鸡肉汁培养基中沙门氏菌生物膜的形成能力要弱于胰蛋白胨大豆肉汤（tryptic soy broth，TSB）[11]。目前，国内鲜有针对肉牛加工环境条件下牛肉源大肠杆菌O157:H7生物膜形成的报道，尤其是针对有肉汁残留的不锈钢表面。因此，牛肉汁培养基（beef extract，BE）和实验室标准培养基对不同大肠杆菌O157:H7生物膜形成的影响是否存在差异尚不清楚。

本实验用BE为生长基质用于模拟真实的食品加工环境，并以实验室标准培养TSB为对照，以不锈钢为接触面，研究牛肉源不同大肠杆菌O157:H7菌株生物膜的形成能力及其菌株特性，为大肠杆菌O157:H7的控制提供指导，从而有助于开发有效的生物膜防控技术。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

TSB、胰蛋白胨大豆琼脂（tryptic soy ager，TSA）、葡萄糖、细菌琼脂粉、LB培养基 北京陆桥技术股份有限公司；氯化钠 国药集团化学试剂有限公司；二甲苯 天津凯通化学试剂有限公司；磷酸盐缓冲溶液 北京索莱宝科技有限公司；不锈钢片（50 mm×20 mm×1 mm，304，2B表面） 江苏浩瑞金属科技有限公司。

1.2 仪器与设备

Thermo 1300A2型生物安全柜 美国Thermo Scientific公司；HF safe-MJQ1型红外线灭菌器 上海力申科学仪器有限公司；5804R型离心机 德国Eppendorf公司；BioTek Epoch2型酶标仪 美国Molecular Devices公司。

1.3 方法

1.3.1 菌种活化

将冻存于－20 ℃的菌株（大肠杆菌O157:H7）接种于新鲜的TSB培养液中，37 ℃培养18 h进行活化，经2 次活化后的菌液以4 ℃、10 000×g离心5 min，去上清液，用无菌生理盐水重复洗涤沉淀2 次，然后用无菌生理盐水重悬后备用。

1.3.2 BE制备

将牛肉除去脂肪并切成小块，以牛肉∶水为1∶2（g/mL）的比例加入蒸馏水，在高压灭菌锅中蒸煮灭菌，将获得的肉汤用纱布过滤后分装备用，在－20 ℃贮存[12-13]。

1.3.3 不锈钢表面生物膜制备

出站的路上，几位火车站的保安大叔半开玩笑的关怀，一下就让人感受到了天津人的热情，似乎身上也暖和了许多！再往前走，一个开出租车的女司机，看我穿得清凉，主动要给我外套，我说不要紧，一会儿上车就暖和了，她还一个劲儿地要我赶紧穿上，而关键问题是我并不是她的客户。最后我还是固执地没有接受她的外套，只好道声“感谢”！

在使用前将不锈钢片冲洗并灭菌。将1.3.1节中的菌液稀释1 000 倍，取100 μL悬浮液转移到20 mL含不锈钢片的TSB或BE中。将所有含不锈钢片的培养基在37 ℃培养7 d。菌株分别在培养1～7 d时计数。将不锈钢片用0.85% NaCl溶液冲洗3 次以除去未附着的细菌，而后用无菌棉签擦拭除去附着的生物膜，再将拭子转移到含有0.85% NaCl溶液的管中并涡旋约5 min，然后制备连续稀释液。通过胰蛋白酶大豆琼脂平板法进行菌落计数用于评估大肠杆菌O157:H7生物膜形成能力[14]。

1.3.4 自聚能力测定

调整1.3.1节中各菌悬液的OD600nm值约至0.8，并准确测定其OD600nm值（A0），将相同体积的各菌悬液置于37 ℃培养6 h，吸取各菌株的等量上清液，并测定其OD600nm（A1），计算各菌株的自聚性能（自聚能力/%=（A0－A1）/A0×100）；各菌株均重复3 次[15]。

1.3.5 泳动能力测定

采用软琼脂平板法测定各菌株的泳动能力。单一菌体泳动能力（swimming）平板的配方为[16]10 g/L胰蛋白胨，5 g/L NaCl，2.5 g/L葡萄糖，0.3%琼脂粉；群体泳动能力（swarming）平板的配方为25 g/L LB，0.5 g/L葡萄糖，0.5%琼脂粉，取3 μL各菌株的悬浮液接种至两种平板的中心位置，在室温下放置20 min，使菌液充分吸收；将swimming平板和swarming平板置于37 ℃培养48 h，测定菌株扩散菌圈的直径大小（mm）；每种平板中各菌株重复3 次。

1.3.6 表面疏水性测定

调整各菌悬液的OD600nm值至1.0±0.2，并准确测定其初始浓度（A0，OD600nm），分别取2 mL的各菌悬液，分别加入2 mL的二甲苯，充分涡旋2 min后，使其在室温静置15 min，充分分层后测定各体系中水相的OD600nm（A1），各测试项均重复3 次[17]。菌株的表面疏水特性计算如下：

1.4 数据处理与统计分析

采用SAS软件（Version 9.0）的混合模型进行交互作用分析，菌株、时间、培养基类型作为对生物膜形成能力影响的固定因素，实验重复及固定效应的交互作用为随机因素，数据使用3 次重复的表示。菌株特性使用ANOVA法进行单因素分析，用Pearson相关系数法进行各参数之间的相关性分析，P＜0.05，差异显著。使用Sigma Plot1 2.5软件进行作图。

2 结果与分析

2.1 生物膜形成能力

BE培养基用于模拟肉类加工环境，以获得与实际加工情况最接近的实验数据。研究发现，本实验使用的所有大肠杆菌O157:H7在2 种培养基中都可以附着在不锈钢表面上（表1），菌株、时间、培养基质的交互作用对生物膜的形成有显著影响（P＜0.05）。

表1 不同大肠杆菌O157:7菌株在不锈钢片上生物膜形成能力Table 1 Biofilm formation abilities of different E. coli O157:7 strains on stainless steel plates

表1 不同大肠杆菌O157:7菌株在不锈钢片上生物膜形成能力Table 1 Biofilm formation abilities of different E. coli O157:7 strains on stainless steel plates

注：肩标大写字母不同表示同一菌株在同一培养基不同时间下差异显著（P＜0.05）；肩标拉丁字母不同表示同一菌株在同一时间不同培养基中差异显著（P＜0.05）；肩标小写字母不同表示不同菌株在同一时间同一培养基中差异显著（P＜0.05）。

lg（CFU/cm2）菌株 培养基质BE 0.00αAa 2.43βBa 2.62βBCa2.69αBCDa2.95αCDa 3.06βDa 3.74βEa 3.84βEb 3.96βEb 104 TSB 0.00αAa 4.11βDEb 4.65βFb 4.16βEb 3.67βCDc3.10βBab3.83βCDEb3.11βBa 3.47βBCb BE 0.00αAa 3.41αBCc 3.30αBb 3.51αBCb3.57βBCDb3.81αCDb3.70βBCDa3.75αCDb 4.01αDb 107 TSB 0.00αAa 2.80βBa 3.26βCa 3.12βBCa3.19βBCb 3.31βCb 3.37βCa 3.13αBCa2.96αBCa BE 0.00αAa 2.61βBb 3.52βDEb3.10βCDab3.58βEb 3.00βBCa 4.22αFb3.17αCDEa3.03αBCa时间 标准误差1 h 12 h 1 d 2 d 3 d 4 d 5 d 6 d 7 d S1 TSB 0.00αAa 2.85βBCa2.90βBCDa3.15βCDa 2.47βBa 2.76βBCa3.37βDEa3.77βEFb 4.08βFc 0.22

3 株菌都在初始1 h内没有产生黏附。所测试的菌株之间的生物膜数量差异显著（P＜0.05），其中，104菌株的最大黏附量要高于S1菌株和107菌株的最大黏附量。3 株菌在不锈钢上的最大黏附数量为4.65（lg（CFU/cm2）），黏附数较低，这可能与接触面的材质有关，表面疏水特性的菌株倾向于黏附在疏水材料表面，表面亲水特性的菌株倾向于黏附在亲水材料表面，表面疏水菌株比亲水细菌更易在接触表面附着，不锈钢片属于亲水材料，细菌在不锈钢上的黏附能力较差[18]。

3 株菌在不锈钢表面产生最大黏附的时间不一致，S1菌株在第7天产生最大黏附，107菌株在第5天形成最大黏附，而104菌株在TSB中生长较快，在第1天形成最大黏附，在BE中生长较慢，在第7天形成最大黏附。

不同的菌株在不锈钢片上的生长趋势不一致，除了所用菌株本身原因之外，还可能是因为培养基质的不同。生物膜形成受到所用培养基类型的影响，对于3 株菌的最大生物膜形成能力来说，在TSB中培养的S1、104两株菌显示出比BE中更高的生物膜形成能力，而107菌株刚好相反。

2.2 菌株特性

图1 不同大肠杆菌O157:7菌株特性Fig. 1 Cell surface hydrophobicity, autoaggregation ability and motility of different E. coli O157:H7 strains

在本研究中，在不同菌株中观察到自聚能力的变化（图1A）。3 株菌的自聚能力不同，其中107菌株的自聚能力要显著高于其他2 株菌（P＜0.05）。由图1B可知，不同菌株的泳动能力有显著差异，S1菌株和107菌株的群体泳动能力显著低于104（P＜0.05），S1和104的单一泳动能力低于107（P＜0.05）。群体泳动能力的结果与大肠杆菌O157:H7在不锈钢上初始黏附的结果一致，S1菌株和107菌株的初始黏附要低于104菌株。如图1C所示，不同菌株疏水性不同。其中，107菌株对二甲苯的亲和力要显著高于其他2 株菌，表明107菌株的疏水性要显著高于其他2 株菌（P＜0.05）。

2.3 生物膜形成能力与菌株特性的相关性

表2 大肠杆菌O157:7菌株特性与生物膜形成的相关性分析Table 2 Correlation coefficients between E. coli O157:7 cell characteristics and biofilm formation ability

表2 大肠杆菌O157:7菌株特性与生物膜形成的相关性分析Table 2 Correlation coefficients between E. coli O157:7 cell characteristics and biofilm formation ability

注：*. P＜0.05，差异显著；**. P＜0.01，差异极显著。BF-TSB或BF-BE表示在相应培养基中生物菌膜（5 d）的形成。

指标 自聚能力 单一泳动 群体泳动 疏水性 BF-TSB单一泳动 0.621群体泳动 －0.117 0.498疏水性 0.914** 0.813** 0.034 BF-TSB －0.297 －0.058 0.694* －0.358 BF-BE 0.601 0.605 0.118 0.669* －0.137

如表2所示，菌株的疏水性与自聚性存在极显著的正相关（P＜0.01），单一泳动能力与疏水性存在极显著的正相关（P＜0.01），TSB中的生物膜形成能力只和群体泳动存在显著正相关（P＜0.05），而BE中的生物膜形成只和疏水性存在极显著正相关（P＜0.01）。除此之外，菌株在2 种培养基质中的生物膜形成能力不存在相关性。

3 讨 论

为了与肉牛加工的环境更为相似，本研究选取不锈钢为菌株的黏附表面，并且使用牛肉汁为菌株培养基质，与TSB进行比较，在这些条件下研究大肠杆菌O157:H7菌株生物膜形成可以获得与实际情况最为类似的信息，对控制实际环境中的大肠杆菌O157:H7更有帮助。不同培养基中的营养成分会影响生物膜菌株的形成，S1、104、107这3 株菌在2 种培养基中的生物膜形成能力并不一致。Li Jiaqi等[9]在LB培养基中补充不同浓度的鸡肉汁，发现补充体积分数50%的鸡汁达到最高的生物膜形成水平，但是纯鸡汁也会使细菌生物膜形成水平显著高于对照组（未添加肉汁）。除此之外，也有研究表明使用一些食物成分（如鱼、牛奶、油和碳水化合物）为生长基质可以增强生物膜的形成，这表明许多食物残留物可能促进各种细菌形成生物膜[10]。与本研究中107菌株的结果类似，107菌株在BE中形成的生物膜比TSB中更强。氯化钠、葡萄糖等营养成分也会影响生物膜的形成，有研究发现，在培养基中添加适量的葡萄糖会促进生物膜的形成[19-20]。

此外，不锈钢是现在肉品加工过程中接触面的主要材质，尤其是自动加工工艺的发展，增加了不锈钢设备的使用，而不锈钢表面与产品的反复接触可能会增加大肠杆菌O157:H7的交叉污染。因此，对于不锈钢表面菌株生物膜的研究十分必要。同一菌株在不锈钢表面与塑料、玻璃、木材、陶瓷等其他材质表面的生物膜形成能力不一致。有学者对来自于食品中的67 种金黄色葡萄球菌在不锈钢及聚苯乙烯上生物膜形成能力进行了研究，发现不同菌株在聚苯乙烯和不锈钢上形成生物膜的能力有相当大的变化，与不锈钢相比，金黄色葡萄球菌生物膜的形成优先发生在聚苯乙烯上[21]。也有研究发现大肠杆菌O157:H7在不锈钢上生物膜形成能力要高于聚丙烯、玻璃[22]。

对3 株大肠杆菌O157:H7菌株特性进行研究发现不同菌株的自聚能力不同，这可能是由于菌株表面物质的差异。这种差异可能是由细胞表面蛋白与个体血清型的特异性改变引起的，特别是与聚集过程中介质表面的相关蛋白有关[23]。此外，大肠杆菌每个细胞的鞭毛在蜂群期间会加倍[24]。而泳动能力与鞭毛的存在有关，通常生物膜的形成与鞭毛数量的增加有关[25-26]。鞭毛可以增加细菌的运动能力，使细菌在泳动期间向有利环境移动，并通过在宿主表面上黏附和形成生物膜提高病原体的毒力[27]。细菌疏水性通常与黏附性有关，会因菌株的不同而不同，并且受细菌表面结构的影响[28]。本研究采用BATH法对大肠杆菌O157:H7的疏水性进行了测定，由于菌株对不同碳氢化合物的黏附程度具有差异，Dillon等[29]研究发现与二甲苯作用产生了最好的反应效果，因此本研究的疏水性是通过与二甲苯的亲和力评估。疏水性的差异可能是由于蛋白质和多糖在不同细菌表面的分布和比例的不同所致，因为蛋白质的存在可能导致更高的疏水性，而更亲水的表面则与多糖的存在有关[30]。菌株的表面特性，如自聚能力、泳动能力、疏水性等，都会对生物膜的形成产生重要影响，菌株表面特性的差异取决于细菌表面物质，尤其是表面蛋白种类和数量的不同会直接影响细菌的表面疏水性和自聚能力，进而影响细菌运动、黏附和生长[28]。

研究发现菌株群体泳动能力、疏水性分别与TSB、BE生物膜形成能力有显著相关性。细菌的菌毛有助于细胞表面的疏水性，大部分菌毛含有高比例的疏水性氨基酸残基，这些残基在细胞表面特性和附着中起作用[31]。有研究表明，细菌细胞疏水性与疏水表面附着之间存在正相关[32]。但也有研究发现大肠杆菌的疏水性与生物膜形成存在负相关[28]。然而本研究发现在TSB中，疏水性与生物膜形成相关性不显著（P＞0.05），BE中生物膜形成和疏水性存在显著的正相关（P＜0.01），疏水性与生物膜形成的相关性可能与菌株的培养基质有关。本研究发现只有TSB中生物膜形成与群体泳动能力存在正相关，但是有研究发现，无论培养的基质如何，运动性都未与单核细胞性李斯特菌的生物膜形成能力呈正相关[33]。自聚能力与2 种培养基中的生物膜形成均没有相关性，然而在其他菌株的研究中有相反的结果，沙门氏菌在TSB中的生物膜形成与自聚能力存在正相关[11]。因此，还需要进一步从胞外聚合物产生量、生物膜的微观结构、生物膜形成相关基因的表达调控等方面研究有关肉汁培养基和实验室标准培养基TSB对不同大肠杆菌O157:H7菌株在不锈钢表面生物膜形成的机制，相关研究正在开展进行中。

4 结 论

大肠杆菌O157:H7可以在工厂中常用的不锈钢表面形成生物膜。其生物膜形成能力受菌株、培养时间和培养基质显著影响且存在交互作用；各菌株的自聚能力、泳动能力、疏水性等指标呈现出显著差异。其中群体泳动能力、疏水性分别与TSB、BE中生物膜形成能力有显著相关性。需要进一步研究不同大肠杆菌O157:H7菌株在不锈钢表面生物膜形成的机制。