响应面法优化桦褐孔菌总三萜回流提取工艺

檀 琪,阮文辉,杨官娥,刘海萍,王进东,*

(1山西医科大学药学院中药学教研室,太原 030001;2山西省医药与生命科学研究院;*通讯作者,E-mail:844381238@qq.com)

桦褐孔菌(Inonotusobliquus)为担子菌门多孔菌科纤孔菌属的真菌[1-3]。生长在温度相对较低的俄罗斯西伯利亚地区的原始森林中,常在树皮破损及伤节处形成肉瘤状菌核,菌块性状为近球形或不定形块状[4,5]。桦褐孔菌是多组分的药用真菌,主要化学成分有20多种,包括多糖、桦褐孔菌素、桦褐孔菌醇、多种氧化三萜类、类固醇类及低分子多酚类等有效成分[6,7]。三萜类化合物为其中的有效部位,具有抗肿瘤、抗氧化、抗炎,降糖等作用[8-12]。文献报道,可采用超声、回流、微波等方法提取桦褐孔菌总三萜类化合物[13-18]。本课题组预备提取纯化出总三萜,研究其药理作用,进一步制作成药物。本文在单因素试验基础上采用响应面设计法,对桦褐孔菌总三萜回流提取工艺进行优化。

1 材料和方法

1.1 材料和试剂

1.1.1 实验原料 桦褐孔菌子实体粉末(购自安徽亳州);白桦脂醇对照品(HPLC纯度>97.6%;ChromaDex,批号:20151008)。

1.1.2 主要化学试剂 香草醛(分析纯,天津市光复精细化工研究所);冰醋酸、高氯酸、异丙醇、乙酸乙酯、甲醇、乙醇(均为分析纯,天津市风船化学试剂科技有限公司)。

1.2 实验仪器

BIOMATE 3S紫外可见分光光度计(Thermo Fisher);BSN-220.3电子天平(北京塞多利斯有限公司);HH-6电热恒温水浴锅(北京市长风仪器仪表公司);GZX-9140电热鼓风干燥箱(上海博迅实业有限公司医疗设备厂);LYNX-6000离心机(Thermo Fisher);振动式药物超微粉碎机(济南倍力粉技术工程有限公司)。

1.3 方法

1.3.1 桦褐孔菌总三萜提取工艺 桦褐孔菌粉末干燥至恒重,超微粉碎8 min,精密称取1.00 g桦褐孔菌粉末,加入提取溶剂,回流提取后离心(3 500 r/min下离心10 min),收集上清液,取上清液测吸光度,计算总三萜含量。

1.3.2 桦褐孔菌总三萜测定 标准曲线的建立:准确称取干燥恒重的白桦脂醇对照品4.0 mg于25 ml的容量瓶中,加入无水乙醇溶解,稀释至刻度摇匀,即为浓度0.16 mg/ml的标准品溶液。精确吸取白桦脂醇对照品溶液0.1,0.15,0.25,0.30,0.35,0.40,0.50,0.55 ml,分别置于10 ml具塞试管,在100 ℃水浴上蒸干后加入0.20 ml新配制的5 g/100 ml香草醛-冰乙酸溶液和0.80 ml高氯酸,摇匀,于70 ℃水浴保温反应15 min,冷却至室温,再加入乙酸乙酯定量至5 ml,摇匀,同时作试剂空白,在550 nm处测定吸光度,以白桦脂醇质量(μg)为横坐标,吸光度为纵坐标,绘制标准曲线Y=aX+b。

总三萜含量测定方法:按1.3.1项下方法提取桦褐孔菌总三萜,按标准曲线的建立操作进行测定,将测得的吸光度值代入标准曲线,按下列公式计算桦褐孔菌总三萜含量:

M0=(A+b)/a

M1=M0×稀释倍数/1 000M

其中:M0为测定吸光度时溶液中总三萜的质量(μg);M1为实验中所取桦褐孔菌中总三萜的含量(mg/g);M为实验中所取桦褐孔菌的量(g);A为所测样品吸光度;b为三萜标准曲线方程截距;a为三萜标准曲线方程斜率。

1.3.3 桦褐孔菌总三萜回流提取单因素试验 选择提取溶剂、回流时间、回流温度、料液比、提取次数共5个因素做单因素实验,以桦褐孔菌总三萜含量为评价提取工艺的指标。

1.3.3.1 提取溶剂对总三萜含量的影响 准确称取4份(每份1.00 g)桦褐孔菌粉末,固定料液比1 ∶20、回流温度80 ℃、回流时间2 h、提取次数1次,改变提取溶剂,分别为异丙醇、乙醇、甲醇、乙酸乙酯,按1.3.1项下方法提取,测定总三萜含量,考察提取溶剂对总三萜含量的影响。

1.3.3.2 回流时间对总三萜含量的影响 准确称取6份(每份1.00 g)桦褐孔菌粉末,固定提取溶剂异丙醇、料液比1 ∶20、回流温度80 ℃、提取1次。改变回流时间,分别为1,1.5,2,2.5,3,3.5 h。按1.3.1项下方法提取,测定总三萜含量,考察回流时间对总三萜含量的影响。

1.3.3.3 回流温度对总三萜含量的影响 准确称取6份(每份1.00 g)桦褐孔菌粉末,固定提取溶剂异丙醇、料液比1 ∶20、回流时间2 h、提取1次。改变回流温度,分别为60,70,75,80,85,90 ℃。按1.3.1项下方法提取,测定总三萜含量,考察回流温度对总三萜含量的影响。

1.3.3.4 料液比对桦褐孔菌总三萜含量的影响 准确称取6份(每份1.00 g)桦褐孔菌粉末,固定提取溶剂为异丙醇、回流温度80 ℃、回流时间2 h、提取1次。改变料液比,分别为1 ∶5,1 ∶10,1 ∶15,1 ∶20,1 ∶25,1 ∶30。按1.3.1项下方法提取,测定总三萜含量,考察料液比对总三萜含量的影响。

1.3.3.5 提取次数对总三萜含量的影响 准确称取5份(每份1.00 g)桦褐孔菌粉末,固定提取溶剂为异丙醇、回流温度80 ℃、回流时间2 h、料液比为1 ∶20。改变提取次数分别为1次至5次。按1.3.1项下方法提取,测定总三萜含量,考察提取次数对总三萜含量的影响。

1.3.4 响应面法优化提取桦褐孔菌总三萜的实验 在单因素实验的基础上,利用Design expert 8.0.6分析软件,选择料液比、回流时间、回流温度3个因素为自变量,每个因素取3水平,以-1,0,+1编码,以桦褐孔菌总三萜含量为响应值,进行实验设计,因素水平设计见表1。

表1 响应面法分析因子及水平表

Table 1 Analysis factors and levels of response surface method

水平因素温度A(℃)时间B(h)料液比C(g/ml)-1752150802.520185325

2 实验结果和分析

2.1 桦褐孔菌总三萜测定

根据总三萜含量和吸光度的关系,以白桦脂醇质量(μg)为横坐标,吸光度为纵坐标,绘制标准曲线为Y=0.008 5X-0.021 9,R2=0.999 4。

2.2 单因素实验结果和分析

由图1提取溶剂的考察结果可知,提取溶剂为异丙醇时,总三萜含量最大。实验中观察异丙醇提取液为淡黄色(接近于无色),其他均为黄色,含有较多的杂质,根据相似相溶原理,总三萜的含量与提取溶剂极性有关,由实验结果可知,异丙醇的极性与桦褐孔菌三萜类化合物最接近,因此,提取溶剂选择异丙醇为宜。

由图1回流时间的考察结果可知,在1-2.5 h内,桦褐孔菌总三萜含量随着时间的增加而增加,当时间2.5 h时,总三萜含量最高;当时间再升高时,含量有所下降。因此,回流时间选择2.5 h为宜。

由图1回流温度的考察结果可知,在提取温度60-80 ℃内,随着温度升高,提取液中总三萜含量增加,但温度>80 ℃后,总三萜含量降低,表明温度>80 ℃以后不利于总三萜类化合物的提取。因此,回流温度选择80 ℃为宜。

由图1料液比的考察结果可知,在料液比1 ∶5-1 ∶20内,随着料液比升高,提取液中总三萜含量增加,但料液比>1 ∶20后,三萜含量增加缓慢,趋于稳定。原因可能是溶剂量的增加会导致传质效率趋于最大,当提取溶剂用量增加到一定程度,该溶剂已将三萜基本溶出。因此,提取料液比选择1 ∶20为宜。

由图1提取次数的考察结果可知,随回流次数增加,总三萜含量略有上升,但基本趋于稳定。一般情况下,总三萜提取量随提取次数增加而上升,但是当提取超过一定次数时,总三萜浸出将达到平衡阶段,总三萜含量基本稳定不变。考虑在实际的生产中,对资源的综合利用,因此,提取次数选择1次为宜。

图1 提取影响因素考察结果Figure 1 Effects of influencing factors of extraction on total triterpenoids in Inonotus obliquus

由图1可知,回流时间、回流温度和料液比对总三萜含量影响较为显著,故以总三萜为指标,以回流温度(因素A)、回流时间(因素B)、液料比(因素C)为考察因素,进行响应面优化实验。

2.3 响应面法优化提取桦褐孔菌总三萜

由表2可知,采用Design-Expert8.0.6软件进行多项式回归拟合,建立多元二次响应面回归模型:Y=13.02-0.16A-0.049B+0.46C+0.062AB+0.17AC-0.020BC-0.59A2-0.44B2-0.65C2。因素的ANOVA分析见表3。可见,F模拟=67.01,且P<0.000 1,表明该模型差异有统计学意义,方程与实际的拟合情况相符;失拟项P=0.170 4,提示失拟检测无显著性,表明未知因素对试验的干扰较小;模型拟合相关系数R2=0.988 5,表明模型可信度较好,该模型可应用于分析和预测提取工艺参数。拟合回归方程各项方差分析结果表明,对于响应值Y,因素一次项A、C,交互项AC,二次项A2、B2、C2都对总三萜提取率的影响显著,其余均无显著性,提示各影响

表2 试验设计与结果

Table 2 Test design and results

试验号 A B C总三萜含量(mg/g)1-1-1012.0021-1012.103-11011.74411012.095-10-111.35610-111.407-10111.80810112.5490-1-111.401001-111.38110-1112.501201112.401300012.901400012.991500013.111600013.051700013.04

因素与提取率之间并非简单的线性关系。由表3可见,单因素A,B,C的F值大小分别为17.46,1.73,156.3,提示单因素对提取率的影响顺序为C(液料比)>A(回流温度)>B(回流时间)。响应面分析的等高线图和响应面图见图2-4,各图为因素A-C中任意1个变量取零水平时,其余2个变量对总三萜含量的影响,可更直观地体现2个因素对提取的影响。

由图2-4可知,桦褐孔菌总三萜的最优提取工艺为提取温度80.92 ℃,提取时间为2.48 h,料液比1 ∶21.9。考虑到实际操作,最终将其确定为料液比1 ∶22,提取温度80 ℃,提取时间为2.5 h,提取1次。

表3 方差分析

Table 3 Analysis of variance

来源 离均差平方和 自由度均方 F P模型6.6490.7467.01<0.0001A0.1910.1917.460.0041B0.01910.0191.730.2302C1.7211.72156.3 <0.0001AB0.01610.0161.420.2723AC0.1210.1210.810.0133BC1.600×10-311.600×10-30.150.7143A21.4711.47133.83<0.0001B20.8310.8375.40<0.0001C21.8011.80163.60<0.0001残差0.07770.011- <0.0001失拟项0.05230.0172.830.1704纯误差0.02546.170×10-3- - 总误差6.7216 -- -

2.4 验证试验

精密称取样品3份,每份1.00 g,按最优提取工艺平行实验3次。结果,总三萜含量分别为13.10,13.12,13.24 mg/g,平均含量为13.15 mg/g,理论预测值为13.12 mg/g,与理论预测值相比,其相对误差约为0.2%。表明预测值与实验值具有良好的一致性,进一步说明该回归模型的准确性和可靠性,具有一定应用价值。

图2 温度和回流时间对总三萜含量的影响Figure 2 Effects of temperature and reflux time on content of total triterpenoids

图3 温度和料液比对总三萜含量的影响Figure 3 Effect of temperature and ratio of solid to liquid on content of total triterpenoids

图4 回流时间和料液比对总三萜含量的影响Figure 4 Effect of reflux time and ratio of solid to liquid on content of total triterpenoids

3 讨论

本试验采用单因素试验确定因素水平,然后进一步应用响应面法考察各影响因素对总三萜含量的影响,再采用二次回归设计得到回归模型,确定最优工艺,最佳提取工艺条件下桦褐孔菌提取物中三萜类含量为13.15 mg/g。本试验仅对三萜这一组分进行提取,为分离纯化三萜提供了基础,与其他方法相比,本方法具有快速,操作成本低,并且对环境无危害等优点,且该工艺稳定,重现性好,可为降低能耗、减少成本和工业化生产提供参考依据。