茅台镇酱香白酒不同轮次主酿区可培养霉菌种群结构多样性

朱治宇，黄永光

（贵州大学酿酒与食品工程学院，贵州省发酵工程与生物制药重点实验室，贵州 贵阳 550025）

以贵州茅台酒为代表的酱香型白酒，因其独特的酿造工艺和优质的口感，受到广大消费者的青睐。与国外的蒸馏酒不同，酱香型白酒酿造属于传统固态发酵，工艺复杂、开放式多菌混合发酵。酱香型白酒独特酿造环境和酿造工艺形成了其独特的微生物体系，致使其形成独特的风格特征：酱香突出、酒体醇厚、幽雅细腻、空杯留香持久[1-5]。研究发现[6]，酱香型白酒酒醅中的微生物来自大曲、原料、空气及地面灰尘，其发酵过程涵盖着细菌、酵母、霉菌等菌群结构复杂的演替。其中，霉菌能够分泌多种酶，包括糖化酶、脂肪酶、蛋白酶和水解酶等，具有分解酒醅中的大分子物质、产生酒体中的风味物质或其前体物质的功能，与整个酱香型白酒风味物质的形成密切相关[7]，其中的丝状真菌能够产生糖化酶作用于原料中的淀粉，提高出酒率[8]，还可提升基酒品质。因此，系统性研究酱香白酒主酿区环境霉菌和大曲霉菌群落结构及其种间演替规律对科学探究酱香白酒发酵具有重要意义。

酒曲是白酒酿造的糖化发酵剂，富含多种酶类和菌类，酱香白酒的酿造用曲量高达1∶1，因此大曲在酿造过程中非常重要[9]。酱香白酒的大曲中含有多类霉菌，已知大多数的霉菌都参与酒醅发酵[10]，研究表明，霉菌代谢为大曲提供了丰富的酶系[11]，推动了大曲的发酵成熟，对大曲淀粉的糖化降解和防止曲块裂口等具有重要意义[12]。其中Aspergillussp.、Absidiasp.、Rhizopussp.、Rhizomucorsp.、Mucorsp.、Penicilliumsp.和Monascussp.是酒曲中主要存在的7 类霉菌，约50 种[13]，游剑等[14]采用传统可培养方法从枝江大曲酒的大曲中分离出Penicilliumsp.、Aspergillussp.和Mucorsp.等霉菌；班世栋等[15]从酱香型白酒大曲中得到了19 株不同的霉菌。但高温大曲中温度和湿度等条件会限制很多霉菌的生长[16]，酱香白酒还需要通过堆积发酵网罗环境中的霉菌来完成发酵[17]，由此可见，研究酿造大曲霉菌菌群结构及主酿区环境微生态霉菌多样性对酱香白酒发酵具有重要意义。

目前，鲜见对茅台镇酱香白酒主酿区环境和大曲霉菌系统性研究，本课题为了从物种分类水平上详细描述茅台镇酱香白酒酿造环境和大曲中霉菌群落的特征性结构[18]，在前期利用宏基因组学系统分析微生物结构的基础上，对茅台镇酱香型白酒7 个不同轮次主要酿造区域（共包括17 家酒企，分为7 个区域）进行取样，采用传统可培养技术和现代18S rRNA聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）产物基因测序技术确定霉菌种属，通过探究霉菌在各轮次种类、数量变化和功能分析（跟踪整个生产期），拟充分认识酱香型白酒1～7轮次中起主导作用的霉菌多样性结构特征、轮次间种群结构差异性以及消亡率、富集率变化，更清晰地从微观角度描述大曲霉菌和环境霉菌对白酒酿造的作用，为今后酱香白酒微生物数据库的建立和微生物层面的工艺优化提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

样品：取自贵州省茅台镇TMS、GT、DDH等17 家酱香型白酒公司的白酒生产车间，2018—2019年1～7轮次主酿区环境样品和大曲样品。

真菌DNA试剂盒 北京索莱宝科技有限公司；霉菌引物（ITS1和ITS4） 北京全式金生物技术有限公司；DAN Marker（DM2000） 宝生物工程有限公司；琼脂糖 南京生兴生物技术有限公司；核酸染料（Gengreen） 上海赛百盛有限公司。

孟加拉红培养基（上海博微生物有限公司）：蛋白胨5.0 g/L、葡萄糖10.0 g/L、磷酸氢二钾1.0 g/L、硫酸镁0.5 g/L、孟加拉红0.033 3 g/L、琼脂20.0 g/L、氯霉素0.1 g/L，pH 7.0～7.4。

麦芽汁液体培养基（上海博微生物有限公司）：麦芽膏粉130.0 g/L、氯霉素0.1 g/L、pH 5.6±0.2。

1.2 仪器与设备

超净工作台 苏州金净科技有限公司；高压蒸汽灭菌锅、台式高速冷冻离心机 美国Thermo Fisher Scientific公司；旋涡混合器 海门市其林贝尔仪器制造有限公司；HH-4数显恒温水浴锅 常州澳华仪器有限公司；CP153电子天平 奥豪斯仪器（上海）有限公司；PCR仪 美国伯乐公司；DYY-8C型电泳仪北京六一仪器厂；JS-680C凝胶成像仪 上海培清科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 样品采集

样品取自贵州省仁怀市茅台镇观音寺区、上坪村、椿树村、岩滩村、向阳村、卢荣坝村及合马镇街道社区共7 个酱香白酒主酿区域的17 个代表性酿酒企业，1～7轮次酒醅堆积发酵期间的主酿区环境样品和生产使用大曲样品。其中环境样品采集包括：将各酒厂生产车间的窗户玻璃、窗台、晾堂及四周地面、墙面、墙角、行车梯子及上表面、配电箱上表面、消防箱上表面、储酒罐和一些平时不易被打扫的角落等处的采样点进行灰尘样品等量采集并均匀混合。

将均匀混合的样品作为该轮次样品（17 家公司1～7轮次共计119 个大曲样品和119 个环境样品），均匀密封袋密封，并立即生物性保藏运回实验室4 ℃冰柜低温保存。准确标记每个取样点以防被破坏，且每次都在相同取样点取样。最终，按照区域划分将每个酒厂的样品等量混合为代表一个区域的最终混合样品（本实验共分为7 个区域，每个区域1 个最终混合样品，7 个轮次共计49 个大曲最终混合样品和49 个环境最终混合样品）。

1.3.2 霉菌菌株分离鉴定

实现“三教融合”的有效路径就是通过农村普法教育的方式和途径，将自治教育和德治教育内容填充其中。这是因为，普法教育内容与自治教育、德治教育存在内容上的交集和方式上的共通。一方面，村民自治教育的主要内容，除了我国现行的《村民委员会组织法》外，一般是村委会自身制定的自治性章程规范，而后者制定的渊源是前者。德治教育的内容离不开法律这一最低的限度，法律既是实现道德的手段，也是衡量道德的标准。另一方面，经过40年的普法教育，无论是传统的说教宣传手段，还是便捷先进的普法形式，在乡村都已经有了相当的经验和固定的通道，利用成熟的媒介进行“三教融合”便利又高效。

取25 g最终样品溶于225 mL生理盐水中[15]，加入玻璃珠，在160 r/min的摇床充分振荡30 min，稀释到不同梯度（取10－3、10－4、10－5三个梯度）并设置3 个平行组，涂布于孟加拉红培养基上置于30 ℃培养箱中培养3～5 d，统计肉眼可见的不同霉菌菌落数目，参照《常见与常用真菌》[19]中的方法鉴定。

1.3.3 霉菌DNA的提取

将初筛所得的霉菌点板于孟加拉红培养基上（设置3 个平行组），30 ℃培养箱中培养3～5 d，取6.5 g麦芽汁培养基溶于50 mL蒸馏水中，灭菌后冷却，在无菌操作台挑取部分菌体置于液体培养基中，在120 r/min的摇床振荡3 d后，取培养基中的菌体研磨，再根据北京索莱宝科技有限公司的柱式真菌基因组DNA抽提试剂盒说明书，对霉菌进行基因组DNA提取，将提取的菌株基因组DNA置于－20 ℃冰箱中保存备用。

1.3.4 PCR扩增及凝胶电泳

霉菌PCR扩增引物：ITS1（5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’）和ITS4（5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’）；PCR体系：2 μL DNA，1 μL Primer 1和1 μL Primer 2两种引物，12.5 μL 2×EsTaqMasterMix和8.5 μL ddH2O，总体系共计25 μL。PCR扩增产物置于－20 ℃冰箱保存至送样。PCR程序：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性60 s；51 ℃退火60 s；72 ℃延伸1 min，其中变性、退火和第1次延伸共经过35 个循环，最后在72 ℃延伸5 min结束。

1.3.5 18S rRNA PCR产物测序

1%琼脂糖凝胶（加有10 μL Gel Red核酸染色剂）检测确定的PCR产物送生工生物工程（上海）股份有限公司测序。后将测序结果在NCBI的BLAST数据库中进行DNA序列比对分析[20]，从而确定霉菌的种属。

斜面保藏：挑取纯化的霉菌接种于已灭菌且凝固的孟加拉红斜面试管中，在30 ℃培养箱中培养2～5 d后置于4 ℃的冰箱保藏。

甘油管保藏：挑取纯化的霉菌菌株于5 mL己灭菌的麦芽汁液体培养基中30 ℃过夜培养，取多个菌丝团稍微研磨成浑浊菌液（约0.5 mL）加入0.5 mL已灭菌的30%甘油于1.5 mL的EP管中混合均匀，每个菌株做3 个甘油保藏，标记并放置于－80 ℃冰箱长期保藏。

1.4 数据处理

使用WPS 2019进行数据统计分析，堆积柱状图使用Origin 8.6绘制，RStudio绘制相对丰度图、Venn图和和弦图。

2 结果与分析

2.1 不同轮次环境和大曲中可培养霉菌菌种分析

整合茅台镇7 个主酿区样品数据作为该轮次数据进行分析，从不同轮次环境和大曲中分别分离得到614 株和486 株霉菌。根据点板霉菌菌落形态及其颜色特征排重，共送检256 株霉菌，通过霉菌18S rRNA基因测序比对分析，结果如表1所示，环境样品中共鉴定得到27 个属57 个种，大曲样品中共鉴定得到15 个属31 个种。

表1 环境和大曲中分离筛选可培养霉菌分析结果Table 1 Separation and identification of culturable molds from the brewing environment and Daqu

续表1

表1 中M4、M6、M32、M46、M54、M67菌ITS的相似度小于98%，因此本实验结合系统树、菌落表征及生理特性等指标的考察，并查阅相关文献报道比对，明确了上述结果的可靠性，菌落表征分析见表2。

如表1所示，从酱香型白酒酿造环境中共筛出27 个属：Lichtheimia、Mucor、Aspergillus、Monascus、Penicillium、Talaromyces、Rhizomucor、Rhizopus、Pleosporales、Coniothyrium、Galactomyces、Ascomycota、Epicoccum、Trichosporon、Paecilomyces、Trichoderma、Syncephalastrum、Gymnomyces、Irpex、Phanerochaete、Trametes、Fusarium、Chaetomium、Schizophyllum、Scopulariopsis、Geotrichum、Phlebia，包括2 种Lichtheimia、17 种Aspergillus、2 种Monascus、5 种Penicillium、5 种Mucor、2 种Rhizopus、2 种Rhizomucor、3 种Talaromyces等57 种霉菌。从酱香型白酒酿造大曲中共筛出15 个属：Lichtheimia、Aspergillus、Monascus、Penicillium、Thermoascus、Phanerochaete、Paecilomyces、Rhizomucor、Irpex、Emmia、Cladosporium、Schizophyllum、Mucor、Trametes、Hyphodontia，包括2 种Lichtheimia、8 种Aspergillus、6 种Monascus、4 种Penicillium等31 种霉菌。

表2 ITS相似度小于98%可培养霉菌菌落表征分析Table 2 Characterization of culturable mold colonies with ITS similarity less than 98%

范光先等[21]以茅台酿造过程中的酒醅、大曲、环境灰尘为样品，利用传统可培养技术分离出51 种霉菌；黄永光[22]从酱香白酒酿造环境及其主要酿造环节中共筛出10 种曲霉：A. niger、A. oryzae、A. terreus、A. tubingensis、A. flavus、A. hennebergii、A. fumigatus、A. niveus、A. candidus和M. ruber，其中有7 种曲霉与本实验结果一致。本课题在酱香白酒酿造区域环境和大曲样品中共分离筛选出霉菌31 个属68 个种，包括17 种Aspergillus和6 种Monascus。由于实验采样区域广泛，涵盖茅台镇多个酱酒主酿区，且对整个生产周期进行了跟踪，使数据较前人研究霉菌种类更丰富。另外，在酱香白酒酿造区域环境和大曲样品中首次检出6 种霉菌：S. racemosum、P. cinnamopurpureum、T. diversiformis、A. pragensis、A. allahabadii、H. palmae，多种霉菌混合发酵为白酒生产提供了丰富的酶系、有利的酸碱环境、多种风味成分和前体物质等[23]。

沈毅等[24]分析了酱香酒醅中真菌微生物的组成及其多样性，发现了Paecilomyces、Thermomyces、Monascus等丰度较高的霉菌；孙剑秋等[25]通过传统可培养技术分离酱香型白酒酒醅中的霉菌，其中Aspergillus、Penicillium、Geotrichum、Monascus、Mucor、Scopulariopsis、Paecilomyces、Cladosporium等属霉菌与本实验发现的霉菌相符；徐佳等[26]研究发现，Monascus、Mucor、Penicillium、Lichtheimia、Aspergillus、Rhizopus等属霉菌是茅台酒醅中常见的霉菌，其中A. nidulans、A. fumigatus、A. candidus、A. flavus、M. rutilus、M. ruber、M. purpureus等精确到种的霉菌与本实验发现的霉菌相符；母应春等[27]运用高通量测序技术分析了贵州省3 个地区的酒曲中微生物群落组成和多样性，结果表明Rhizopus、Aspergillus和Thermomyces是酒曲中优势霉菌；李静心等[28]运用高通量测序技术从白酒高温大曲和中高温大曲中分离出Aspergillus、Thermomyces和Rhizomucor等高丰度霉菌。本实验中Thermomyces在大曲中丰度较高，但在环境中未筛出，分析原因可能是该菌嗜热，环境温度较低不适合该菌的生长；对比前人研究发现，酱香白酒酒醅发酵过程中多种霉菌与本实验研究相符，说明酿造大曲和环境为酒醅发酵提供了主要微生物来源。

2.2 不同轮次环境中可培养霉菌种群结构分析

2.2.1 多样性结构分析

图1 不同轮次环境中霉菌相对丰度Fig. 1 Relative abundance of molds from the brewing environment in different fermentation rounds

将环境样品中鉴定得到的霉菌按照GB 4789.15—2016《食品微生物学检验 霉菌和酵母计数》方法计数[29]，运用软件Origin 8.6绘制上述酿造环境中57 种霉菌在1～7轮次相对丰度堆积柱形图。从图1可以看出，至少在1 个轮次平均相对丰度大于20%的霉菌包括4 个属4 个种，分别为L. corymbifera21%、M. circinelloides21.58%、P. variotii24.37%和S. commune21.17%；至少在1 个轮次平均相对丰度大于10%的霉菌包括6 个属12 个种，分别为L. corymbifera、L. ramosa、M. circinelloides、M. racemosus、A. sydowii、A. flavus、A. tritici、A. oryzae、Monascussp. Atc8、R. pusillus、P. variotii、S. commune。综上研究表明，Lichtheimia、Mucor、Aspergillus、Monascus、Rhizomucor、Paecilomyces、Schizophyllum等属霉菌是酱香白酒酿造环境中具有绝对优势的霉菌，其中Aspergillus的种类多达4 种，说明Aspergillus在酱香白酒酿造过程中发挥重要作用，与前人研究相符[25-26]。另外，霉菌种类在2、3、4、5轮次最多，其中第4轮次霉菌种类多达13 个属21 个种。说明酱香白酒发酵过程中2、3、4、5轮次是发酵最主要的几个轮次，其中第4轮次中霉菌数量和种类均最多，是发酵的核心轮次。该结果与杨大金等[30]研究相符，被称为“大回酒”的3、4、5轮次酒具有产酒率高、酒质好、酱香风味突出等特点。另外，前期应用Illumina高通量测序分析霉菌菌群结构，主酿区环境样品中得到4 个门、20 个科、89 个属，对比本实验数据，有75%以上的属能与高通量数据对应，25%左右的属未在高通量数据中对应。分析原因可能是培养条件和分析方法的不同，使得数据在可接受范围内产生一定的差异。相对而言，高通量测序技术能更全面准确地分析样品微生态结构，而传统可培养技术较具局限性，适用于分析有限优势菌群结构[31]。本实验中优势霉菌与高通量测序分析结果基本一致，证实了本实验的可靠性。

分析霉菌的消涨可知，Lichtheimia在1～6轮次趋于稳定，第7轮次未筛出该菌；Mucor在1、5、6、7轮次含量较高，2、3、4轮次含量较低；Aspergillus、Monascus随轮次的增加逐渐减少；Rhizomucor在1、6、7轮次含量较高；Paecilomyces随轮次先增加后减少，在3、4、5轮次含量较高；Schizophyllum分布轮次较少，主要集中在3、4轮次。原因主要是发酵前期原料淀粉含量较高、温度较低，发酵中期受季节影响温度较高，发酵后期淀粉含量和环境温度均降低，Lichtheimia具有产热稳定性淀粉酶的能力[32]，适合在高温、高淀粉含量条件下生长，而第7轮次温度降低及原料中淀粉含量减少不利于该菌生长；Mucor和Rhizomucor适合在适宜的条件下生长，温度升高则被抑制[33]；Aspergillus和Monascus酶系丰富[34-35]，当原料逐渐消耗殆尽[36]，其含量也逐渐下降；Paecilomyces和Schizophyllum适合在高温条件下生长[37-38]，随温度的降低受到抑制。综上表明，在茅台镇酱香型白酒发酵过程中，霉菌种群多样性结构随着发酵轮次的进行发生改变，说明不同发酵轮次对霉菌生长具有调控作用，霉菌种类和优势霉菌的更替产生丰富的酶系对酱香白酒酒体的饱满具有积极促进作用[7]。

2.2.2 轮次间种群结构差异性分析

图2 不同轮次环境中相对丰度大于5%的霉菌Upset图Fig. 2 Upset plot of molds with relative abundance greater than 5%from the brewing environment in different fermentation rounds

运用软件RStudio绘制不同酿造轮次环境相对丰度大于5%（共23 种）霉菌Upset图，见图2。对环境样品中57 种霉菌进行筛选，得到23 种霉菌相对丰度大于5%。由左侧条形图可知，3、4、5轮次种类优势明显，其中4轮次最多；右侧Upset图表明，23 种霉菌有6 种单独出现在2、6、7轮次中，剩余17 种霉菌具有轮次间的传承性，其中，3、4轮次之间有10 种共有霉菌，4、5轮次之间有9 种共有霉菌，3、4、5轮次之间6 种共有霉菌。结果表明，茅台镇酱香白酒酿造环境中各轮次霉菌之间存在一定的共性特征，且特征霉菌稳定性较强，迁移率较高，具有数量和种类的传承性。

另外，上述23 种霉菌在第1轮次发酵起始时发现9 种（相对丰度和占88.54%），到第7轮次发酵结束时剩余3 种（相对丰度和占38.71%），消亡率高达49.83%；有5 种霉菌发酵起始时未发现，但在发酵结束时检出（相对丰度和占61.29%）；有9 种霉菌仅出现于发酵中间阶段，即2～6轮次（相对丰度和占比分别为34.04%、6.72%、37.23%、25.17%、24.00%，均低于50%）。消亡率与富集率较高说明不同发酵阶段对霉菌调控作用明显，而各阶段霉菌存在差异性为各轮次白酒生产提供更丰富酶系，但差异性低于相似性说明各阶段起主导作用的霉菌具有较强的传承性。

2.3 不同轮次大曲中可培养霉菌种群结构分析

2.3.1 多样性结构分析

将大曲样品中鉴定得到的霉菌按照上述方法，绘制酿造大曲中31 种霉菌在1～7轮次相对丰度堆积柱形图，见图3。至少在1 个轮次平均相对丰度大于20%的霉菌包括4 个属5 个种，分别为L. corymbifera20.55%、L. ramosa27.27%、A. allahabadii20.00%、P. sordida25.64%、T. crustaceus22.06%；至少在1 个轮次平均相对丰度大于10%的霉菌包括5 个属8 个种，分别为L. corymbifera、L. ramosa、A. allahabadii、P. griseofulvum、P. citrinum、P. crustosum、P. sordida、T. crustaceus。综上研究表明，Lichtheimia、Aspergillus、Penicillium、Phanerochaete、Thermoascus等属霉菌是酱香白酒酿造区域大曲中具有绝对优势的霉菌，对比本实验结果与前人研究基本相符[26-27]。但R. pusillus数量和轮次分布均较少仅在第1轮次发现，对比环境中R. pusillus的生长状况，认为该菌虽然具有一定的耐热性[39]，但酱香白酒中高温大曲的温度过高，不适合该菌的生长。值得注意的是，本实验发现A. allahabadii是大曲中的优势霉菌，也是首次在酱香白酒大曲中被发现，但该结果并没有前人研究证实，原因可能是：1）本实验涉及白酒主酿区域较广，样品较多，实现了数据的创新；2）该菌原本并非优势菌，但由于样品采集导致环境条件改变，有利于该菌的繁殖；3）平板培养的环境条件适合该菌的生长。实验后期采用空白平板筛选实验室环境中的霉菌，并未发现该菌，证明该菌是样品本身携带。研究发现A. allahabadii可以产生包括β-葡糖苷酶、β-半乳糖苷酶在内的多种酶，其中β-半乳糖苷酶的产量最高，该酶可以水解多糖中的端链半乳糖残基、降解抗营养因子，提高人体免疫力，是一种功能性很强的有益菌[40]，但是否为大曲中的优势菌种以及在大曲中发挥的作用，还待后续进一步的研究。另外，前期应用Illumina高通量测序分析霉菌菌群结构，主酿区生产大曲样品中得到5 个门、17 个科、68 个属。对比本实验数据，有80%以上的属和能与高通量数据对应，而优势霉菌Penicillium与高通量测序分析结果略有不同，原因可能是可培养条件较适宜该菌的生长，使其成为本实验的优势菌种。

图3 不同轮次大曲中霉菌相对丰度Fig. 3 Relative abundance of molds from Daqu in different fermentation rounds

分析霉菌的消涨可以发现，Lichtheimia在2、3、4轮次含量较低，6、7轮次含量较高；Aspergillus在1、7轮次含量较高，5、6轮次含量较低；Penicillium在各轮次含量趋于稳定；Phanerochaete在1～5轮次含量较高，6、7轮次含量较低；Thermoascus在3～7轮次含量较高，2轮次含量较低，1轮次中未发现。分析原因可知，传统酱香高温大曲品温高达60 ℃左右，加之发酵中期受季节影响温度较高，抑制了包括Lichtheimia、Aspergillus等微生物的生长，Penicillium耐高温性不好，在不利的条件下会以孢子形式存在，样品采集后条件改变使得孢子萌发，导致其在各轮次含量趋于稳定[41]；Thermoascus能够在45 ℃以上的高温环境中生长代谢，并产生耐热的纤维素酶和木聚糖酶[42]，在环境样品中未筛出该菌，而大曲却对Thermoascus进行了富集。实验结果表明，高温大曲会对环境中的霉菌进行筛选和富集，从而抑制酸败菌的生长，促进高温细菌和嗜热霉菌的繁殖[43]，有利于酱香白酒酒体的成型与稳定[11-12]。

2.3.2 轮次间种群结构差异性分析

图4 不同轮次大曲中相对丰度大于5%霉菌Upset图Fig. 4 Upset plot of molds with relative abundance greater than 5%from Daqu in different fermentation rounds

对大曲样品中31 种霉菌进行筛选，得到18 种霉菌相对丰度大于5%（图4）。由左侧条形图可知，各轮次霉菌种类差异性不大，1轮次种类最多，4轮次最少；右侧Upset图表明，18 种霉菌有3 种单独出现在2、3轮次中，剩余15 种霉菌具有轮次间的传承性，其中，有5 种霉菌在7 个轮次都被发现。对比环境霉菌，酿造大曲各轮次霉菌之间传承性更强，推测原因是由于外界环境比曲房更复杂，曲房内稳定的环境更有利于霉菌的传承与迁移。

上述18 种霉菌在第1轮次发酵起始时发现12 种（相对丰度和占90.40%），到第7轮次发酵结束时剩余7 种（相对丰度和占79.09%），消亡率为11.31%；有2 种霉菌发酵起始时未发现，但在发酵结束时检出（相对丰度和占20.91%）；有4 种霉菌仅出现于发酵中间阶段，即2～6轮次（相对丰度和占比分别为9.01%、11.97%、0%、15.87%、2.21%）。结果表明，大曲中起主导作用霉菌传承性极强，各阶段霉菌差异性较低，消亡率远低于环境（49.83%），正是由于高温大曲对优势霉菌具有良好的传承和筛选特性，加之酱香白酒用曲量较大[9]，使得这些优势霉菌进入酒醅后迅速主导发酵。本实验诠释了“曲为酒骨”，用微观的角度分析了制曲的重要性。

2.4 不同轮次环境与大曲霉菌种群结构差异性分析

图5 环境和大曲中霉菌种群Venn图Fig. 5 Venn diagram showing the number of molds at the genus and species level between the brewing environment and Daqu

图6 不同酿造轮次环境及大曲中霉菌种群和弦图分析Fig. 6 Chord diagram showing the relative abundance of molds between the brewing environment and Daqu

绘制Venn图和和弦图直观分析酱香白酒酿造区域环境及大曲中霉菌的共性与特性，见图5、6。大曲霉菌中有11 个属与环境一致，占大曲总属73.33%，各轮次相对丰度和分别为99.32%、96.53%、86.33%、85.25%、92.06%、77.94%和85.45%；大曲霉菌中有20 个种与环境一致，占大曲总种的64.52%，各轮次相对丰度和分别为75.33%、79.84%、81.19%、85.25%、75.39%、63.98%和85.45%。值得注意的是，酱香型高温大曲曲坯初入房时并非高温，此时温度较低湿度较高，适合笼络环境中多种微生物生长和代谢，随着温度的升高实现了对嗜热微生物的筛选[37]。上述结果可知，大曲与环境中霉菌类群相似度较高，说明大曲在曲房开放式发酵过程中与环境霉菌资源具有一定的交集作用，而大曲通过品温上升的筛选，最终实现环境、原料等外界中的有益霉菌向大曲迁移富集。

环境霉菌中有16 个属在大曲中未发现，占环境总属59.26%，各轮次相对丰度和分别为11.44%、7.81%、5.04%、4.38%、2.88%、0%和24.74%；环境霉菌中有37 个种在大曲中未发现，占环境总种64.91%，各轮次相对丰度和分别为11.44%、39.74%、11.76%、16.06%、25.17%、26.00%和35.50%。结果显示，环境中存在多种霉菌，其中未进入大曲发酵的霉菌种类超过50%。众所周知，酱香白酒堆积发酵是自然网罗、富集酿造环境中微生物过程，能够形成独特的微生物菌群结构[2]，以上数据证实了酱香白酒堆积发酵网罗环境中微生物的重要性。

综上可知，酱香白酒酿造区域环境中存在种类繁多的霉菌，无论是高温大曲的制作工艺还是堆积发酵工艺，都是为笼络环境中霉菌为后续发酵提供微生物动力。从微生物角度分析，若发酵过程中舍弃撒曲仅靠堆积发酵笼络环境微生物，会使有益霉菌无法主导发酵或因生物量不足延长发酵时间，从而严重影响白酒口感甚至使酒醅变质；若舍弃堆积发酵，虽然大曲提供了主导发酵的有益霉菌，但如图6所示，各轮次将有30%左右霉菌被摒弃。

表3 部分相对丰度小于5%可培养霉菌功能总结分析Table 3 Functions of selected culturable molds with relative abundance less than 5%

由表3可知，部分丰度较小的霉菌同样具有产香功能，可见，若舍弃环境中这些丰度较小的霉菌可能会对酱香白酒品质产生重要影响。

3 结 论

对茅台镇酱香白酒7 个主酿区1～7轮次环境和大曲中可培养霉菌种群结构多样性进行研究，分别分离得到614 株和486 株霉菌，通过形态特征和18S rRNA基因测序比对分析，共送检256 株霉菌，最终环境样品中鉴定得到27 个属57 个种不同霉菌，大曲样品中鉴定得到15 个属31 个种不同霉菌。通过对不同轮次酿造环境和大曲中可培养霉菌多样性结构分析，明确了Lichtheimia、Mucor、Aspergillus、Monascus、Rhizomucor、Paecilomyces、Schizophyllum等属是酱香白酒酿造环境中具有绝对优势的霉菌；Lichtheimia、Aspergillus、Penicillium、Phanerochaete、Thermoascus等属是酱香白酒酿造大曲中具有绝对优势的霉菌，通过对比前人研究发现，酱香白酒酒醅发酵过程中多种霉菌与本实验研究相符，说明酿造大曲和环境为酒醅发酵提供了主要微生物来源。

通过对轮次间可培养霉菌种群结构差异性分析，证实了不同轮次环境中霉菌之间存在一定的共性特征，且特征霉菌稳定性较强，迁移率较高，具有数量和种类的传承性。通过对比消亡率和富集率，进一步说明不同发酵阶段对霉菌调控作用明显，各阶段霉菌存在的差异性为各轮次白酒生产提供更丰富酶系，但差异性低于相似性说明各阶段起主导作用的霉菌具有较强的传承性；对比环境霉菌，酿造大曲各轮次霉菌之间传承性更强，各阶段霉菌差异性较低，消亡率远低于环境，起主导作用霉菌具有极强传承性，该结论诠释了“曲为酒骨”，从微观的角度分析了制曲的重要性。

通过对环境与大曲霉菌种群结构差异性分析，发现大曲与环境中霉菌类群相似度较高，说明大曲在曲房开放式发酵过程中与环境霉菌资源具有一定的交集作用，而大曲通过品温上升的筛选，最终实现环境、原料等外界中的有益霉菌向大曲迁移和富集。另外，实验发现环境中有37 种（各轮次相对丰度和占30%左右）霉菌未在大曲中筛出，证实了酱香白酒堆积发酵网罗环境中微生物的重要性。本实验深入剖析了环境霉菌和大曲霉菌对酱香白酒发酵的重要意义，从微生物角度诠释了高温大曲和堆积发酵都是酱香白酒中不可分割的酿造工艺。