高通量测序分析原香型白酒高温大曲的细菌群落

杨 旭 ，马歌丽，王光路，胡晓龙，宋丽丽，张志平，张治刚，王永亮

（1.郑州轻工业大学食品与生物工程学院，河南郑州 450001；2.郑州市代谢工程和系统生物学重点实验室，河南郑州 450001；3.贾湖酒业集团有限责任公司，河南漯河 462400）

大曲作为一种重要的发酵剂和专用原料，对中国白酒的品质至关重要[1]。众所周知，大曲中的丰富酶系和各种微生物是原料中大分子物质水解和代谢的必要条件。此外，大曲还为白酒酿造提供了大量的风味物质和前体物质以及有益的代谢产物。

大曲是在开放环境下自然发酵生产的。生产模式包括简单的手工制曲和大规模的工业制曲。到目前为止，传统大曲生产无论采用何种模式，都主要依靠熟练技术人员对工艺参数的调节，其中大曲中微生物主要来自原料和周围环境。近20 年来，现代分子生物学方法被用来研究酱香、浓香、清香等不同类型白酒大曲的微生物群落。例如，在上述3 种香型白酒大曲中，乳杆菌属均占优势，而芽孢杆菌属在浓香和酱香大曲中为优势菌群[2]。扣囊复膜孢酵母和横梗霉在清香和浓香型白酒大曲中占优势，而疏棉状嗜热丝孢菌主要出现在酱香型白酒大曲中[3]。不同类型大曲微生物群落的差异也与环境条件有关。例如，水分和酸度胁迫导致了嗜热微生物结构的转变[4]。大曲生产过程中的温度也是微生物群落组成的重要因素[5]。

目前关于北方不同香型白酒（如原香型）大曲中微生物相关的研究较少。贾湖酒业集团有限责任公司地处我国北部河南省漯河市，通过改进生产工艺，独创生产出的原香型白酒具有“口感绵柔，醇香四溢”的风格特点。

本研究以贾湖酒业集团有限责任公司所生产的原香型白酒高温大曲为样品，以南方高温大曲为对照，比较研究了高温大曲的理化性质和细菌种类的不同，以期从细菌层面解析南北方白酒风格差异的可能形成原因。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

实验用高温大曲原料是由河南漯河贾湖酒业集团有限责任公司提供的原香型白酒高温成品大曲（北方大曲，简写JH）和对照大曲（南方大曲，简写MT）。原料大曲分别粉碎后迅速置于-20 ℃下保藏备用。

1.2 仪器与设备

分光光度计（Beckman Coulter）；电热恒温鼓风干燥箱、生化培养箱、电热恒温水浴锅（上海一恒科技有限公司）；电子天平（梅特勒-托利多仪器有限公司）；立式压力蒸汽灭菌器（上海博讯实业有限公司），超净工作台（苏州净化有限公司）；PCR 仪器（Eppendorf有限公司）。

1.3 实验方法

1.3.1 大曲水分含量测定

将两个干净的培养皿在100～105 ℃的恒温干燥箱中烘干，当烘干至恒重时记作W0，在天平上连同培养皿称取大约10 g 的预先研磨好的大曲样品，记作W1，将培养皿在100～105 ℃干燥箱中烘干，记下重量，再在干燥箱中烘干至恒重记下重量为W2。

1.3.2 大曲酸度测定

用天平称取10 g 的粉末状大曲样品于烧杯中，加水100 mL，常温下放置0.5 h，用脱脂棉对样液过滤。将大曲浸出液用移液枪吸取1 mL 到一个干净的锥形瓶中，由于受浸出液颜色的影响需要加入9 mL 的水对其进行稀释，加酚酞2～3 滴，摇匀，用氢氧化钠溶液滴定，当溶液的颜色变得微红，并且10 s内颜色不褪去就是滴定终点[6]。

式中：C——氢氧化钠溶液浓度（mol/L），V——氢氧化钠溶液体积（mL）。

1.3.3 大曲蛋白酶活力测定

将在40 ℃预热的大曲浸出液1 mL 加入1 mL酪蛋白溶液（2%），保温10 min，加入2 mL 0.4 mol/L三氯乙酸溶液终止酶解反应后离心；取1 mL 上清液分别加入5 mL 0.4 mol/L 碳酸钠溶液、1 mL 福林试剂，在40 ℃下保温20 min，测定680 nm波长处的OD值。

1.3.4 高通量测序方法

使用DNA 提取试剂盒从样本中提取DNA，使用Qubit® dsDNA HS Assay Kit 检 测DNA 浓 度。以20～30 ng DNA 为模板，使用金唯智设计的一系列PCR 引物扩增原核生物16S rDNA 上包括V3 及V4 的2 个高度可变区。采用包含“CCTACGGRRBGCASCAGKVRVGAAT”序列的上游引物和包含“GGACTACNVGGGTWTCTAATCC ”序列的下游引物扩增V3 和V4 区。另外，通过PCR 向16S rDNA 的PCR 产物末端加上带有Index 的接头，以便进行NGS 测序。PCR 反应参数：预变性参数94 ℃3 min × 1，变性参数94 ℃5 s，退火参数57 ℃90 s，延伸72 ℃10 s，终延伸参数72 ℃5 min，共进行24 个循环。PCR 扩增结果鉴定：PCR 产物用1.5%琼脂糖凝胶电泳检测。委托苏州金唯智生物科技有限公司采用按Illumina MiSeq(Illumina,San Diego,CA,USA)仪器使用说明书进行PE250/PE300 双端测序，由MiSeq 自带的MiSeq Control Software(MCS)读取序列信息。

2 结果与讨论

2.1 大曲理化性质分析

衡量大曲样品的理化性质，可以用水分、酸度和蛋白酶活力等理化成分指标进行比较，结果如表1所示。根据制曲车间大曲质量检验标准的相关规定，大曲中的水分含量不能超过13%[7]，该条件下大部分微生物都停止了生长、繁殖和代谢。大曲在添加到原料中发酵生产白酒时，处于休眠状态的微生物重新复苏，参与粮食的糖化、发酵、酯化等过程。由表1 可看出，大曲JH 和MT 样品中水分都达到要求，均为合格大曲。大曲酸度是评定大曲质量的重要指标，酸度主要是由产酸微生物在大曲中进行有机酸代谢形成。结果表明，大曲JH 的酸度低于大曲MT，说明大曲JH 中产酸微生物的数量少于大曲MT（后文中高通量分析结果也证实该结论），同时也归因于大曲JH中蛋白酶活力更高[8]。

2.2 大曲细菌组成和多样性分析

大曲样品运用PCR 方法扩增16S rRNA 的V3和V4 区进行高通量测序，进行细菌多样性分析，结果如表2。样本文库覆盖率（Coverage 指数）达到1，说明本次测序结果能代表样本的真实情况，完全能够反映该区域细菌群落的种类和结构。大曲样品微生物多样性指数估计值的结果表明，大曲JH细菌群落多样性略低于大曲MT，这可能是造成南北方白酒品质差异的原因之一。

大曲样品的细菌结构组成（属水平）如图1 所示。大曲JH 中优势细菌为蛋白酶产生菌Virgiba-cillus，其相对丰度达到61.01%，而大曲MT 中蛋白酶产生菌Virgibacillus相对丰度只有17.44%，该结果同表1 中蛋白酶活力测定结果相对应，说明大曲JH 由于蛋白酶产生菌为优势菌具有较好降解原料蛋白质的能力。蛋白酶能分解原料中蛋白质产生各种氨基酸，参与美拉德反应有利于促进大曲风味前体物质的形成，形成浓厚的曲香。

高温放线菌属Kroppenstedtia在大曲JH中相对丰度达到了17.66%，高于大曲MT的1.08%。耐热高温细菌的存在主要由于高温大曲特殊的工艺条件有关，大曲可维持在一个高温高湿的环境，从而形成独特的、具有特殊香气的高温大曲[9]。

另外，由表2 结果可知，大曲JH 的微生物多样性低于大曲MT，在细菌结构上主要表现在大曲MT 中还含有适量不动细菌属Acinetobacter（相对丰度3.98%）、酵母属Saccharopolyspora（相对丰度2.61%）、芽孢杆菌属Scopulibacillus（相对丰度0.65%）和链霉菌属Streptomyces（相对丰度0.69%），魏斯氏菌属Weissella和乳杆菌属Lactobacillus也均被检测出。这些多样性细菌在大曲JH中均未检测到。结果表明，南北方大曲同属于高温细菌大曲，但细菌的多样性不同，南方大曲中细菌种类明显多于北方大曲，该结果同印璇的研究结果一致[10]。蒋红军[11]研究结果表明，细菌多样性主要成因是环境因素，由于气候条件的不同，南方酿造厂区因地理位置的特殊性，空气流动性较北方差，白酒车间附近的微生物种群经多年筛选驯化，环境中的有益于酿酒的微生物区系基本保持一个动态平衡。

3 结论

本研究对北方高温大曲JH 和南方高温大曲MT 培制过程中的细菌变化情况进行了分析，并对大曲的相关理化指标水分、酸度和蛋白酶活力进行了测定，简单分析了大曲中细菌群落结构组成的不同及酸度和蛋白酶活力之间的相互联系，得出南北方高温大曲在理化指标和细菌组成之间的差别，是造成南北方白酒品质差异的主要原因之一。

从分析结果来看，北方高温大曲JH 中优势菌为蛋白酶产生菌Virgibacillus，相对丰度高于南方大曲MT，造成大曲JH 蛋白酶活力较高，有利于原料蛋白质的降解产生多种氨基酸参与美拉德反应促进大曲风味前体物质的形成，形成浓厚的曲香。高温放线菌属Kroppenstedtia在大曲JH中相对丰度达到了17.66%，高于大曲MT的1.08%。

大曲JH 微生物多样性低于大曲MT，如大曲MT 中不动细菌属Acinetobacter、酵母属Saccharopolyspora、芽孢杆菌属Scopulibacillus、链霉菌属Streptomyces、魏斯氏菌属Weissella和乳杆菌属Lactobacillus在大曲JH 中均未检测到。这可能是由于南北方气候的差异，使得南方大曲中酿酒微生物组成上更加丰富，因此有南方适于酿造酱酒的说法，而北方大曲中细菌组成稍微单一，也是能够酿造原香型白酒的原因之一。以上结果能够为揭示南北方白酒品质差异和大曲的生产工艺改良提供理论依据。