白假丝酵母环核苷酸磷酸二酯酶2的异源表达、纯化与酶学特性分析

李赤霞，陈 滢，张 萌，陈玉娟，田元元，王友升,3,

（1.北京食品营养与人类健康高精尖创新中心，北京工商大学轻工科学技术学院，北京 100048；

2.山东凯普菲特生物科技有限公司，山东 日照 276800；3.日照华伟大健康产业研究院，山东 日照 276800）

白假丝酵母（Candida albicans）属于食源性致病酵母菌[1]，近年来在国内外食品中常检出C. albicans，其中乳制品是易被其污染的第一大类产品[2]。C. albicans在正常情况下呈卵圆形，不引起疾病，而当机体免疫力低下或菌群失调时，会改变生长形式，出芽生成假菌丝并感染机体细胞，最终导致生理性疾病的发生[3]。C. albicans作为食品中的条件致病菌，其致死率可达40%[4]，所以对其毒性和菌丝生长的研究极为重要。环磷酸腺苷（cyclic adenosine monophosphate，cAMP）和环磷酸鸟苷（cyclic guanosinc monophosphate，cGMP）作为生物体内第二信使调控着重要的生理代谢反应，而磷酸二酯酶（phosphodiesterase，PDE）是降解环核苷酸的一类酶[5]。在哺乳动物细胞中存在约30 种PDE，但是在真菌生物中，目前仅有两类PDE被发现，其中PDE1属于II类PDE超家族成员，而PDE2属于I类PDE超家族成员，其对cAMP具有较高的亲和力[6-8]，且PDE2与人类PDEs蛋白具有相似的折叠结构[9]。研究表明，cAMP信号通路在酵母的细胞壁合成、细胞生长等生长代谢活动以及致病毒性中起到重要作用[10-16]；同时，Wilson等[14]对C. albicansPDE的研究表明，pde2基因的缺失会导致菌丝发育不完全和细胞壁不完整，从而对其毒性产生影响；有学者证明部分抑菌剂对C. albicans抑菌作用的主要机制是抑制PDE2蛋白的表达[17-19]。所以目前对C. albicansPDE2蛋白的研究已成为其假菌丝生长和毒性调控的重要研究方向。

本研究将大肠杆菌作为表达载体，通过异丙基硫代半乳糖苷（isopropyl-β-D-thiogalactoside，IPTG）诱导目的蛋白异源表达，利用3 种层析方法进行纯化，获得高纯度C. albicansPDE2蛋白，并通过高效液相色谱（high performance liquid chromatography，HPLC）分析PDE2蛋白酶的特性。旨在为该蛋白的晶体学分析及C. albicans的生理病理机制研究提供前期基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 菌体与质粒

野生型C. albicans，大肠杆菌感受态细胞Top10、BL21，质粒pET28a和pGEM-T，均为本实验室保存。

1.1.2 试剂

NheI、EcoRI内切酶 美国Biolab公司；DNA回收试剂盒、高纯质粒小提试剂盒、DNA分子质量标准Marker 美国Thermo公司；cAMP、cGMP、卡那霉素、Tris-base 美国Amresco公司；乙二胺四乙酸钠中国北京西陇化工有限公司；氯仿 国药集团化学试剂有限公司；X-gal 美国Sigma公司；IPTG 美国Thermo Fisher Scientific公司；酵母浸粉、胰蛋白胨 北京奥博星生物技术有限公司；氯化钠 北京化工厂；琼脂中国Biotopped公司。

Ni-NTA agarose 德国Qiagen公司；Q-SepharoseTMFast Flow、SephacrylTMS200 High Resolution 美国GE Healthcare公司。

1.2 仪器与设备

French PressSL-650D超声破碎仪 南京顺流仪器公司；层析实验冷柜 北京博医康实验仪器有限公司；HVE-50高压灭菌锅 日本Hirayama公司；PHS-3D pH计 上海仪表有限公司；Forma Class II净化工作台美国Thermo公司；5810R台式冷冻高速离心机 德国Eppendorf公司；2695 HPLC仪 美国Waters公司。

1.3 方法

1.3.1 基因组DNA提取

C. albicans在酵母浸出粉胨葡萄糖（yeast extract peptone dextrose，YPD）培养基中28 ℃、200 r/min条件下培养过夜，A600nm达到2.0～3.0后离心集菌，并参照王继英等[20]的酚-氯仿法提取C. albicans的基因组DNA。

1.3.2 重组质粒载体的构建

根据C. albicanspde2基因序列（NCBI Gene ID：3636877）设计引物，该基因CDS序列全长为1 716 bp[21]。上游引物序列为：5’-CGGCTAGCATGTCATTTGAAA TCACAAT-3’（下划线为NheI酶切位点）；下游引物序列为：5’-CGGAATTCTACTATAATTGAGGTGCCAC-3’（下划线为EcoRI酶切位点）。引物扩增目的基因片段连接至pGM-T载体，采用热激法转化至大肠杆菌Top10感受态细胞，37 ℃培养16 h进行菌落PCR扩增，鉴定插入片段。将已鉴定目的基因片段连接到pET28a载体上，最终获得pET28a-C. albicanspde2重组质粒，重组质粒通过NheI和EcoRI双酶切鉴定[22]。

1.3.3 pET28a-C. albicanspde2重组质粒诱导表达

将pET28a-C. albicans pde2重组质粒转入到大肠杆菌BL21感受态细胞中，经37 ℃过夜培养后，接种至含0.4%葡萄糖的LB培养基中。0.1 mmol/L IPTG 12 ℃低温诱导48 h后，10 000 r/min离心5 min收集菌体。十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulfatepolyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）分析诱导0、24、48 h菌体中目的蛋白的表达含量。

1.3.4C. albicansPDE2蛋白分离纯化

1.3.4.1 菌体破碎

按照1∶10的比例加入提取液并重新悬浮收集的表达菌体，超声破碎（工作5 s，间歇8 s）菌体30 min，10 000 r/min离心30 min后，分别对破碎总蛋白、上清液蛋白以及沉淀蛋白进行SDS-PAGE检测[23]。

1.3.4.2 基于重组蛋白多重性质的分离纯化

参照Zhang Wei等[24]的方法进行Ni-NAT柱分离纯化，将超声破碎上清液蛋白加入至Ni-NAT柱吸附并洗脱收集目的蛋白。Ni-NAT纯化后的C. albicansPDE2蛋白透析置换24 h后，加入牛凝血酶于室温酶切3 h。酶切后的蛋白加入Q-Sepharose柱进行分离纯化后，超滤浓缩至10 mL左右。浓缩蛋白进行Sephacryl S200分子筛纯化[25]。Ni-NAT柱、Q-Sepharose柱和Sephacryl S200柱分离纯化过程中测定蛋白收集液的A280nm，A280nm等于1被定义为蛋白浓度为1 U，收集蛋白进行SDS-PAGE和非变性凝胶电泳检测分析。最终蛋白浓缩至10 mg/mL并冷冻保存。

1.3.5C. albicansPDE2蛋白酶活力测定

分离纯化的C. albicansPDE2蛋白应用HPLC进行酶学特性测定，参照Hou Jing等[26]方法。反应体系采用单一底物和双底物两种方式检测重组蛋白的酶活特性，反应温度25 ℃，反应时间30 min。根据cAMP和cGMP的峰面积，计算反应底物的水解率。

色谱条件：色谱柱：Intertsil ODS-3（4.6 mm×250 mm，5 μm）。流动相A为0.02 mol/L KH2PO4溶液，流动相B为甲醇，洗脱条件为82% A、18% B。检测波长252、258 nm，柱温30 ℃，流速1 mL/min，进样量20 μL。

2 结果与分析

2.1 C. albicans pde2基因克隆

运用酚-氯仿法提取C. albicans基因组DNA，结果见图1a，在10 000 bp以上有明显条带，证明成功获得了C. albicans基因组DNA。利用C. albicans pde2基因引物，通过PCR扩增目的基因片段，DNA凝胶电泳如图1b所示，在1 500～2 000 bp之间有明显的条带，大小与C. albicans pde2基因的大小（1 716 bp）一致，证明目的基因片段可以被正确扩增。

图1 C. albicans基因组DNA（a）及目的基因PCR扩增产物（b）凝胶电泳Fig. 1 Agarose gel electrophoresis patterns of C. albicans genomic DNA (a) and PCR amplified product of target gene (b)

2.2 重组质粒载体构建

将扩增所得C. albicans pde2目的片段与pGM-T载体相连，双酶切验证电泳结果见图2a，3 000 bp处条带为载体pGM-T条带，1 700 bp处条带为目的基因条带，证明成功获得pGM-T-C. albicans pde2质粒。将酶切后胶回收产物与pET28a载体酶切产物连接，获得重组pET28a-C. albicans pde2质粒。对所构建的重组质粒进行双酶切验证，由图2b可知，酶切后在6 000 bp和1 700 bp左右有明显条带，其中6 000 bp处为pET28a质粒载体条带，1 700 bp左右的条带为目的基因条带，证明重组pET28a-C. albicans pde2质粒构建成功。

图2 C. albicans pde2目的基因PCR扩增产物与质粒双酶切琼脂糖凝胶电泳Fig. 2 Agarose gel electrophoresis patterns of C. albicans pde2 and plasmid subjected to double enzymatic digestion

2.3 pET28a-C. albicans pde2重组质粒诱导表达

IPTG低温诱导48 h后收集菌体5 g/L，分别取样诱导24 h和48 h的菌体，SDS-PAGE见图3。诱导24 h，蛋白表达量较少，几乎没有目的蛋白条带。诱导48 h后，60 kDa处蛋白含量显著增加，该条带与预期目的蛋白（约62 kDa）条带一致，表明该诱导条件能够在IPTG诱导48 h后获得大量的目的蛋白，最终获得菌体4.5 g/L。

图3 C. albicans PDE2蛋白不同诱导时间表达水平SDS-PAG分析Fig. 3 SDS-PAGE results of C. albicans PDE2 protein samples expressed at different times

2.4 C. albicans PDE2蛋白的分离纯化

将C. albicansPDE2表达菌体超声破碎后取样进行SDS-PAGE，结果如图4a所示，离心上清液中目的蛋白含量极高，证明该诱导条件下目的蛋白水溶性较强，形成极少量的包涵体。将离心上清液蛋白加入Ni-NAT亲和层析柱中进行分离纯化，最终获得70 U蛋白。对蛋白含量大于1 U收集管取样进行SDS-PAGE，结果见图4b，目的蛋白条带占比高，说明重组目的蛋白与Ni-NAT柱亲和能力强，且经过蛋白纯度明显升高。证明Ni-NAT柱能够对目的重组蛋白进行有效的分离纯化。

图4 C. albicans PD2蛋白超声破碎及Ni-NAT纯化SDS-PAG结果Fig. 4 SDS gel electrophoresis profiles of crude PDE2 protein from ultrasonically disrupted C. albicans cells and Ni-NAT purified protein

Ni-NAT柱分离纯化后的蛋白，进行24 h的透析置换。牛凝血酶切除目的蛋白的His-tag标签，使目的蛋白更好地与Q-Sepharose柱结合，结果见图5a，经过3 h的室温酶切，蛋白分子质量有明显降低，证明该酶切条件适合重组目的蛋白。酶切后的蛋白质经过Q-Sepharose柱分离纯化，共收集目的蛋白55 U，结果如图5b所示，电泳结果几乎没有杂蛋白条带，说明杂蛋白的含量明显降低，因此证明Q-Sepharose柱可以使目标蛋白得到进一步分离纯化。

图5 C. albicans PD2蛋白酶切（a）及Q-Sepharose柱纯化（b）SDS-PAG结果Fig. 5 SDS gel electrophoresis profiles of enzymatically cleaved C. albicans PDE2 (a) and Q-Sepharose purified protein (b)

将Q-Sepharose柱纯化的蛋白浓缩并加入Sephacryl S200柱，通过分子筛分离纯化，SDS-PAGE检测结果如图6a所示，Sephacryl S200柱纯化后，目的蛋白纯度得到进一步提高。利用非变性凝胶电泳检测浓缩后纯化蛋白的活性，如图6b所示，结果表明经过多步纯化后，目的蛋白条带清晰可见且没有杂蛋白条带，说明Ni-NAT柱、Q-Sepharose柱和Sephacryl S200柱分离纯化过程中C. albicansPDE2蛋白没有发生凝聚，能够维持其生理结构和生物学活性，且蛋白纯度得到极大提高。

图6 C. albicans PD2 Sephacryl S200柱纯化SDS-PAG（a）及非变性凝胶电泳（b）结果Fig. 6 Purification of C. albicans PDE2 on Sephacryl S200 column (a)and non-denaturing gel electrophoresis results (b)

表1 C. albicans PD2蛋白纯化回收率Table 1 Recovery of purified C. albicans PD2 protein

表1 C. albicans PD2蛋白纯化回收率Table 1 Recovery of purified C. albicans PD2 protein

菌体质量/g Ni-NTA Q-Sepharose Sephacryl S200 平均蛋白收集量/（U/g）蛋白回收率/%10 70 100 55 78.57 28 40 2.8蛋白收集量/U蛋白回收率/%蛋白收集量/U蛋白回收率/%蛋白收集量/U

以Ni-NTA柱纯化得到的蛋白含量为100%，计算Q-Sepharose柱和Sephacryl S200柱纯化过程中蛋白的回收率。如表1所示，C. albicansPDE2蛋白在每步纯化过程中，损耗约30%蛋白，这可能是由于蛋白纯度的增高导致，同时在经历柱层析时，目的蛋白也存在着一定量的流失。最终平均每克表达菌体可获得2.8 U目的蛋白。

2.5 C. albicans PDE2蛋白酶活性分析

应用HPLC法测定所获得的目的蛋白酶活力，测定不同浓度蛋白对cAMP和cGMP的水解率，且将底物设置为0.4 mmol/L的单底物与双底物两种体系，通过其对两种体系的水解情况，确定其对于cAMP和cGMP的亲和作用，结果如表2所示。在单底物的情况下，相同质量浓度的C. albicansPDE2对cGMP的水解能力略低于cAMP，说明C. albicansPDE2对cAMP具有更高的亲和力。在双底物的体系中，0.385 mg/mL质量浓度下，0.05 mmol/L和0.1 mmol/L浓度的cAMP能够被完全水解，但0.05 mmol/L浓度的cGMP水解率仅达到了53.53%，说明双底物体系中C. albicansPDE2优先水解cAMP。因此，两种体系均证明了C. albicansPDE2对cAMP具有更高的亲和力。

表2 不同质量浓度C. albicans PD2对底物的水解率Table 2 ydrolysis efficiency of substrates by different concentrations of C. albicansPD2

表2 不同质量浓度C. albicans PD2对底物的水解率Table 2 ydrolysis efficiency of substrates by different concentrations of C. albicansPD2

%酶质量浓度/（mg/mL） 底物 cAMP/cGMP（0.4 mmol/L）0.05 mmol/L cAMP＋0.35 mmol/L cGMP 0.1 mmol/L cAMP＋0.3 mmol/L cGMP 0.2 mmol/L cAMP＋0.2 mmol/L cGMP 0.35 mmol/L cAMP＋0.05 mmol/L cGMP 0.385 cAMP 77.11±13.35 100.23±0.01 100.12±0.01 99.55±0.72 87.17±1.91 cGMP 61.15±24.09 64.12±6.77 63.66±9.53 55.96±27.48 53.53±1.58 0.077 cAMP 28.42±1.63 100.23±0.01 62.67±4.39 42.71±2.91 52.31±24.88 cGMP 20.81±0.19 16.39±2.09 15.92±3.3 19.51±0.82 27.05±16.62 0.015 3 cAMP 8.88±1.34 21.34±9.54 20.27±5.64 12.8±0.74 10.56±3.1 cGMP 7.48±0.13 5.9±2.67 8.62±0.62 9.56±1.13 7.62±0.4

3 结 论

目前，广大研究学者对真菌的调控进行了广泛研究，其中环核苷酸磷酸酶PDE能够对真菌起到重要的调控作用。如Zhang Haifeng等[27]对稻瘟病菌的毒性作用机制的研究中，发现两种pdeL/pdeH基因对菌丝生长、孢子生成等起到重要调控作用；有研究通过过量表达酵母菌的pde2基因，使酵母具有较高的乙醇耐受性[28-29]。因此以上结论充分证明了真菌胞内PDE2对于菌体的生长代谢及致病性有着重要的调控作用。本研究通过IPTG诱导大量表达蛋白菌体，通过多种柱层析手段对目的蛋白进行分离纯化，最终得到高纯度的C. albicansPDE2蛋白，平均每克表达菌体可获得2.8 U蛋白。通过HPLC检测底物减少量或产物生成量分析蛋白酶的水解能力，从而确定所获得的酶活力。结果表明所纯化的蛋白具有较高的水解cAMP和cGMP的能力，其在0.385 mg/mL质量浓度下，对0.4 mmol/L的cAMP和cGMP的水解率达到60%～70%，这与前期报道酿酒酵母PDE1作用方式一致[30]。但是该酶对cAMP的亲和力高于cGMP。本研究得到高纯度、高活性的C. albicansPDE2，为蛋白的晶体学解析提供前期基础，以期进一步筛选以该酶为靶点的天然活性物质，以及解析食品中C. albicans的生长和致病性调控机制。