生产中丙丁菌及其常见杂菌的镜检形态研究

黄玉涛 吕晓丹 薛 宝 郑世文

（河南天冠企业集团有限公司，河南 南阳 473000）

生产中丙丁菌及其常见杂菌的镜检形态研究

黄玉涛 吕晓丹 薛 宝 郑世文

（河南天冠企业集团有限公司，河南 南阳 473000）

根据长期的镜检经验，对丙丁菌整个生长周期菌体形态进行具体划分，另外，对常见的杂菌也进行镜检分析，以使不同的员工可以通过镜检快速地掌握菌体情况，及时发现前期染菌等异常现象，为生产提供决策。

丙丁菌；杂菌；镜检

丙酮丁醇简称总溶剂，是一种重要的有机溶剂和化工原料，广泛应用于喷漆、炸药、塑料、制药、植物抽提取及有机玻璃、合成橡胶等工业，具有十分广阔的前景[1]。丙酮丁醇梭状芽孢杆菌2018菌株（简称丙丁菌）是发酵法生产总溶剂的重要菌株，此菌株营厌氧兼中性生长，跟大多数的细菌相似，在菌体整个发酵过程中，可分为静止期、发酵期、结束期三个阶段，按菌龄则可分为幼年期、青年期、中年期、壮年期和老年期五个阶段，每个阶段菌体都有其自身的形态，通过长期的镜检可以很轻松地判断出菌体的生长阶段和健康程度，特别是对于丙丁菌来说，早期的镜检更是发现杂菌污染的重要手段，杂菌中最重要的一种就是乳酸杆菌[2]，该菌初始时候形态跟丙丁菌很相似，没有充足镜检经验的镜检工是很难在早期发现的，往往是等镜检发现的时候，乳酸菌已经大量繁殖，丙丁发酵已经失败无可挽回。所以对丙丁发酵的菌体镜检进行经验总结非常必要，根据在天冠集团溶剂分厂多年从事丙丁发酵并且产业化的工作经历，细化总结出丙丁菌的各个阶段的菌体形态及杂菌的经验，使之细化统一，并应用于生产实践，对于镜检员工的快速培养，减少染菌都具有一定的作用

1 丙丁菌划分依据

在生产上一般是根据菌体形态结合发酵pH曲线（或酸度曲线）来划分各个不同时期，因为随着pH的不断变化，丙丁菌的功能也不断的发生变化，比如对于pH-t曲线图。

从上图我们可以很明显划分出五个阶段：0-12 h属于幼年期，12-20 h属于青年期，20-32 h属于中年期，32-40 h属于壮年期，40 h以后菌体逐步衰老，进入老年期。

虽然不同的影响因子或多或少的影响到丙丁菌发酵曲线，但总的来说，对于单罐间歇发酵来说，变化不大。

2 丙丁菌的镜检标准

陈陶声、陆祖祺发酵法丙酮丁醇生产技术③一书中，介绍了一种生产上老镜检工所自制的一套镜检评语标准如下：

生长时期幼年期青年期中年期壮年期老年期评语刚发量少分裂3分嫩4分小4分尸体3分拉长分裂嫩3分大4分小3-4分稍老3分粗壮续裂嫩3-4分粗壮4分小3分老了

这是一套很详细的方法，但是由于时代久远，有些术语难于理解，并且根据实际工作情况来看没有必要分的这么详细，在丙丁菌的发酵过程中，幼年期、青年期和老年期的划分都相对来说比较容易，主要是中年期和壮年期这两个时期菌体比较相似，加上时间段也比较短所以不是太好区分，因此，笔者认为只要把这几个阶段的菌体写清楚，使镜检工人能够很快的掌握就可以了，以使生产上能够有判断标准。

丙丁菌的镜检需在油镜下观察，观察的项目主要有：菌体大小，长短，粗细，数目如何？菌体排列形状，菌体形态是否均匀？有无破损，卷曲，空洞现象，有无芽孢？染色是否正常？镜检的时候要综合考虑这些因素，才能准确地把握住发酵效果。具体五个时期的菌体形态如下所述：

幼年期

幼年期Ⅰ：菌体单个居多，有很少数几个短链状分裂，排列杂乱无规律，也有少量的衰老和死菌体；幼年期Ⅱ：菌体大部分呈长链状分裂，有的可以达到好几个镜检视野的程度，少数单个或短链，菌体形态比较均匀，密度明显增大。如果菌体粗壮，颜色均匀统一，则表明生长旺盛，如果菌体拉长，但比较纤细瘦弱，则发酵不好。幼年期一般对应发酵时间在0-12 h之间。

青年期

菌体全部为长链或大部分断裂为单个或短链状，同时断裂开来的菌体变得短、小，梭状非常明显，镜检时能看到有的地方菌体数多，有的地方菌体数少，成扎堆式扇形分布，菌体分裂现象明显，菌体形态不均匀，有的菌体较长，有的菌体较短，还有刚分裂出的菌体最小，几乎成为一个圆点。如果染乳酸杂菌，这个时期也是镜检的关键时期。此时期对应12-20 h左右。

中年期

菌体在开始一段时间比较粗壮短小，分裂排布也有一定规律，这时不再呈扇形和扎堆式排列，而是呈现整齐的排状分布，菌体形态比较均匀，没有或很少有过嫩过老的菌体，密度达最大值，菌体呈短链交织在一起。如果染乳酸杂菌，这时候一般的镜检工是可以判断出来的。这个时期对应20-32 h左右。

壮年期

壮年期菌体的长度、粗细均达到最大。没有任何排列规律而言，视野下全部是密密麻麻交错排列的菌体，颜色很均匀，两端的梭状比较明显.如果染乳酸杂菌，经阿培式染色后可以清晰地看出乳酸杂菌。这个时期对应32-40 h左右。

老年期

老年期Ⅰ：菌体密度比壮年期明显下降，菌体形态变得松散，一部分菌体弯曲成弧形或小圆圈状，还有一些变短、变细，有的中空、断裂等残缺，菌体短小瘦弱；老年期Ⅱ：菌体数量很少，完整的菌体不多，大部分呈单个，有的缺失，菌体进一步收缩卷曲，最后消失，有时能看到单个圆球形孢子。

以上五个标准经班组项目推广以后，取得了明显的效果，镜检效率大大提高，准确性也有保障，受到了一致好评。

3 丙丁发酵常见杂菌的镜检

丙丁菌发酵工业中，常见的杂菌有两大类，球形菌和杆状杂菌，球形杂菌主要是乳酸菌，单个或成短串珠状，一般是风过滤器积水夹带所染，在镜检过程中也比较容易辨认，由于此杂菌不会对丙丁发酵造成影响，只是与丙丁菌共生，消耗基质而已，并且只要加强风系统的管理维护，就能避免这种杂菌污染，所以并不严重。

杆菌杂菌中有一种是比丙丁菌和杆状乳酸菌粗两三倍以上的粗杆菌，这种杆菌镜检视野很明显，个大，且染色比较重，繁殖也非常慢，对生产也几乎没有影响。

丙丁发酵过程中危害最大的一种是杆状乳酸菌，阿培氏染色后菌体上会出现三个亮点，两端和中间各一个，因此被称为三头菌，一旦染上这种菌，酸度就会很快上升，不像正常的丙丁发酵那样当酸度升到最高后，然后下降还原成溶剂，此菌由于刚开始菌体少，在丙丁菌幼年期的时候是检测不到的，只有经过十几个小时的繁衍，在镜检视野中密度达到两三个视野有一个杂菌的时候才能被熟练的镜检工发现，虽然这种杂菌和丙丁菌非常相似，但在镜检的时候还是能看出在美兰染色后此菌比较有柔韧感，稍显细长，染色不均匀，再经阿培氏染色后能看到有红棕色菌体，而正常的丙丁菌是无色透明的。所以镜检工的经验就非常重要，早发现几小时，就可以及时地采取重灭菌，加药等一系列灭菌挽救措施，对于大生产来说经济效益十分可观。

[1]沈兆兵，杜风光，史吉平，董青山，王文博.丙酮丁醇生产技术进展[J].广州化工，2007，（10）35.

[2]陈陶声，陆祖祺.发酵法丙酮丁醇生产技术[M].北京：化学工业出版社，1991.

TS26

A

1671-0037（2014）06-26-1.5

黄玉涛（1984-），男，本科，助理工程师，研究方向：生物能源与生物化工。