pH值偏移处理对油莎豆蛋白结构及乳化性质的影响

王 琳，周国卫，于志超，孟洛冰，王玉莹，张安琪，王喜波，江连洲

（东北农业大学食品学院，黑龙江 哈尔滨 150030）

油莎豆又名油莎草、老虎豆、铁荸荠，是一种莎草属植物[1]。油莎豆富含油脂、糖、蛋白质及维生素等，极具开发价值[2]。油莎豆尤其适合糖尿病患者和消化系统疾病患者食用，同时它还具有预防心脏疾病的作用[3]。油莎豆蛋白含有18 种氨基酸，总氨基酸含有29.88%，其中必需氨基酸占46.03%，非必需氨基酸占53.97%[4]。油莎豆蛋白可分为清蛋白、球蛋白、醇溶蛋白和谷蛋白，其中清蛋白为主要的蛋白组分（82.23%～91.93%），球蛋白、醇溶蛋白和谷蛋白含量较少（3%～7.5%）[5]。油莎豆蛋白虽然具有良好的营养价值，但是其溶解性及乳化性质还有待提高。

乳化性质是蛋白质的重要功能性质。从各种天然来源提取的植物蛋白质可以用作乳化剂，因为它们能够促进形成乳液，并改善乳液的稳定性[6]。乳化性作为蛋白加工过程中重要的功能指标，是决定蛋白在生产实践中应用的重要体现，是影响蛋白产品品质稳定性的关键因素。提高乳化性有利于改进食品组织结构、口感、外观，以提高食品保存性[7]。因此乳化性是目前植物蛋白的研究热点。pH值偏移对大豆等蛋白结构及乳化性已有部分研究，发现它不会产生毒性和安全性等问题[8]。Jiang Jiang等[8]研究发现，极端酸性pH值处理可以引起大豆蛋白的结构发生改变，从而提高其乳化性。Zhang Yanjun等[9]研究了pH值对菠萝蜜蛋白乳化性的影响，发现菠萝蜜蛋白的溶解度首先随pH值的增加而降低，随pH值进一步增加溶解度增加，在中性条件下的菠萝蜜蛋白显示出更高的乳化活性和乳化稳定性。Renkema等[10]研究发现，肌球蛋白、卵蛋白经pH值偏移处理后，侧链相互作用减弱，蛋白分子的三级结构受到很大破坏。目前关于油莎豆的报道还主要集中于油莎豆的种植、油莎豆中油脂及蛋白提取的工艺优化，而关于pH值偏移处理对油莎豆蛋白结构及乳化性的影响鲜见报道。本实验主要研究pH值偏移对油莎豆蛋白结构及其乳化性的影响，为油莎豆蛋白未来在食品中的广泛应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

油莎豆（市售），油莎豆粉碎后，过60 目筛，用正己烷进行脱脂处理，得脱脂油莎豆粕。十二烷基硫酸钠（sodium dodecyl sulfate，SDS） 美国Sigma公司；低分子质量蛋白质Marker、5×蛋白上样缓冲液 索莱宝生物科技有限公司；其他试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

UV-3600Plus型紫外-可见分光光度计、FTIR-8400S型傅里叶变换红外光谱仪 日本岛津公司；ULTRA-TURRAX T18 Basic型高速分散机 德国IKA公司；FD5-series型冷冻干燥机 美国西盟国际集团；F-4500荧光分光光度计 日本日立公司；Mastersizer 2000型粒度分布仪 美国布鲁克海文仪器公司；Gel Doc EZ imager型凝胶成像仪 美国Bio-Rad公司。

1.3 方法

1.3.1 油莎豆粕基本成分分析

粗蛋白含量：按GB 5009.5—2016《食品中蛋白质的测定》方法测定；粗脂肪含量：按GB 5009.6—2016《食品中脂肪的测定》方法测定；淀粉含量：按GB 5009.9—2016《食品中淀粉的测定》方法测定；总糖含量的测定参考苯酚-硫酸法；水分含量：按GB 5009.3—2016《食品中水分的测定》方法测定；灰分含量：按GB 5009.4—2016《食品中灰分的测定》方法测定；粗纤维含量：按GB/T 5009.10—2003《植物类食品中粗纤维的测定》方法测定。

1.3.2 油莎豆蛋白提取工艺流程

脱脂油莎豆粕→pH 8.5碱提→离心→pH 4.5酸沉→离心→沉淀水洗3 次→复溶调pH 7→冷冻干燥→油莎豆蛋白。

工艺条件：将脱脂油莎豆粕与去离子水以体积比1∶15混合搅拌均匀，用NaOH调pH值至8.5浸提1.5 h，于8 000×g离心20 min。取上清液用HCl调pH值至4.5，再于8 000×g离心20 min。取沉淀水洗3 次，取少量水溶解沉淀并用NaOH调pH值至7.0，冷冻干燥即得油莎豆蛋白，蛋白质量分数约为72%，蛋白提取率为63.42%，通过凯氏定氮法（N×6.25）测定所得。油莎豆蛋白基本成分分析方法同1.3.1节。

1.3.3 pH值偏移处理油莎豆蛋白

配制pH值分别为3、4、5、6、7、8、9、10的磷酸盐缓冲液（0.01 mol/L），将油莎豆蛋白分散于不同pH值的磷酸盐溶液中并于磁力搅拌器上室温搅拌，使其充分溶解，4 ℃静置过夜。

1.3.4 聚丙烯酰胺凝胶电泳分析

参考Laemmli等[11]的方法并加以改进，配制5%的上层胶和13%的下层胶备用。将蛋白样品稀释为5 mg/mL，并与5×SDS上样缓冲液以4∶1进行混合，沸水处理5 min。将冷却后的蛋白溶液吸取7 μL注入样孔。初始电压设定为90 V，进入下层胶时设定电压为120 V。电泳结束后将凝胶条用考马斯亮蓝染色液（R250）染色过夜，之后用脱色液脱色3～4 次，采用Gel Doc EZ imager型凝胶成像系统分析电泳条带。

1.3.5 傅里叶变换红外光谱分析

将处理后的蛋白样品进行冷冻干燥，将1 mg样品和溴化钾粉末混合磨粉并压制成片，用于傅里叶变换红外光谱（Fourier transform infrared，FTIR）[12]进行全波段扫描，设定参数为扫描次数32 次，测量范围为4 000～400 cm－1，分辨率为4 cm－1。

1.3.6 粒径分布的测定

将蛋白样品用磷酸盐缓冲液（0.01 mol/L）稀释至1 mg/mL，粒度仪规格：颗粒折射率1.460，平衡时间120 s，分散剂折射率1.330。

1.3.7 紫外扫描

参照Morales等[13]的方法，将蛋白样品用磷酸盐缓冲溶液（0.01 mol/L）进行稀释，使其质量浓度为2 mg/mL，于紫外-可见分光光度计进行紫外扫描，设置波长范围200～400 nm，扫描速率为100 nm/min。实验值取3 次扫描的平均值。

1.3.8 内源荧光光谱

参照文献Liu Yan等[14]的方法，并略作修改。将蛋白样品用磷酸盐缓冲溶液（0.01 mol/L）进行稀释，使其质量浓度为0.2 mg/mL，于荧光分光度计进行扫描。设定狭缝宽度5.0 nm，电压700 mV，发射波长300～400 nm，激发波长290 nm，扫描速率5 nm/s。

1.3.9 浊度测定

采用Kurganov等[15]的方法。将处理后的蛋白样品用磷酸盐缓冲液（0.01 mol/L）进行稀释，使其质量浓度为2 mg/mL，用旋涡振荡器将其混合，于紫外-可见分光光度计波长400 nm处测定其OD值，用所得OD值表示浊度。

1.3.10 溶解度测定

参考Samoto等[16]的方法。将样品用磷酸盐缓冲液（0.01 mol/L）稀释后10 000×g离心20 min。取上清液适度稀释，采用Lowry法测上清液中蛋白含量，以牛血清白蛋白为标准物制作标准曲线。

溶解度按式（1）计算：

1.3.11 表面疏水性测定

参照Haskard等[17]的方法，略作修改。将不同条件下的样品溶液用磷酸盐缓冲液（0.01 mol/L）稀释为不同质量浓度（0.2、0.1、0.05、0.025 mg/mL）。然后将20 μL 1-苯胺基萘-8-磺酸（1-anilino naphthalene-8-sulfonic acid，ANS）溶液（8.0 mmol/L，pH 7.0）分别加入上述配制好的不同质量浓度溶液，用旋涡振荡仪充分混合，将其放置在暗环境中反应15 min。设置发射波长为470 nm，激发波长为390 nm，在此条件下测定样品的荧光强度。以蛋白浓度为横坐标，荧光强度为纵坐标作图，斜率表示蛋白表面疏水性。

1.3.12 乳化性及乳化稳定性测定

参照Pearce等[18]的方法。将蛋白样品用磷酸盐缓冲液进行稀释，使其质量浓度为2 mg/mL，以体积比3∶1将蛋白溶液与大豆油混合，用高速分散均质器于11 000 r/min搅打1 min，于0 min和10 min分别从底部吸取溶液100 μL，将其加入到10 mL 0.1%的SDS溶液中混合均匀，用紫外-可见分光光度计于波长500 nm处分别测定吸光度，以SDS溶液作为空白。其乳化活性（emulsifying activity index，EAI）和乳化稳定性（emulsification stability index，ESI）按式（2）、（3）计算：

式中：N为稀释倍数100；T为常数2.303；L为比色池光径1 cm；φ为油相体积分数0.25；C为乳化液形成前蛋白溶液的质量浓度，10 mg/mL；A0、A10分别为乳状液在第0、10分钟的吸光度。

1.4 数据统计分析

所有实验重复3 次，使用SPSS 19统计软件进行数据的处理与分析，使用Origin 9.0软件作图，Peakfit 4.12软件计算蛋白二级结构相对含量。

2 结果与分析

2.1 油莎豆粕及油莎豆蛋白的主要成分

对油莎豆粕的基本组成成分进行测定分析，结果见表1。

表1 油莎豆粕的主要成分Table 1 Main components of C. esculentus L. dregs

表2 油莎豆蛋白的主要成分Table 2 Main components of C. esculentus L. protein

由表1可知，油莎豆粕中的粗蛋白、淀粉和总糖含量较高，具有很好的潜在利用价值。对油莎豆蛋白的基本组成成分进行测定分析。由表2可知，凯氏定氮法测得蛋白质质量分数为（72.12±0.24）%。

2.2 SDS-PAGE图谱

图1 油莎豆SDS-PAG图Fig. 1 SDS-PAGE pattern of C. esculentus L. protein

由图1 可知，油莎豆蛋白亚基分子质量分布于97.4～14.4 kDa之间，由凝胶成像仪分析可知其主要亚基分子质量分布为17～22、31～38、75 kDa。由此可知，油莎豆蛋白多肽亚基大多数分布于低分子质量（＜43 kDa）范围中。在高分子质量（＞94.7 kDa）范围内未见条带分布。Codina-Torrella等[5]也得出相似结论。

2.3 FTIR分析

图2 p值偏移处理对油莎豆蛋白FTIR光谱的影响Fig. 2 Effect of pH-shifting treatment on the FTIR spectrum of C. esculentus L. protein

Zhang Qiuting等[19]报道FTIR光谱上的酰胺I区域（1 600～1 700 cm－1）主要表示酰胺基团的C＝O弯曲振荡。每个子峰和二级结构之间的对应关系如下：α-螺旋为1 648～1 664 cm－1，β-折叠为1 615～1 637 cm－1和1 682～1 700 cm－1，β-转角为1 664～1 681 cm－1，无规卷曲为1 637～1 648 cm－1[20]。油莎豆蛋白的FTIR光谱如图2所示。由表3可知，随pH值增加，二级结构中β-折叠相对含量显著降低，α-螺旋相对含量显著增加，β-转角和无规卷曲相对含量也略有增加。多肽链上羰基和氨基之间的氢键是维持α-螺旋稳定的主要作用力[21]。油莎豆蛋白等电点为4.5，在中性条件下蛋白带负电荷，在酸性条件下α-螺旋相对含量低可能是因为蛋白分子间电荷发生中和反应，产生静电作用，影响氢键的稳定性[22]。说明静电作用和氢键稳定性都会影响α-螺旋含量[23]。β-折叠含量还与蛋白质的疏水相互作用有关，其含量降低表明分子内部的疏水性位点暴露，疏水性增强[24]，因此在pH 6～9的范围内，油莎豆蛋白β-折叠相对含量降低，表面疏水性增加。随着pH值增加，β-转角相对含量也略有增加，也可以说明pH值增加使蛋白质结构更加舒展[25]。

表3 p值偏移处理对油莎豆蛋白二级结构的影响Table 3 ffect of p-shifting treatment on the secondary structures of C. esculentusL. protein

表3 p值偏移处理对油莎豆蛋白二级结构的影响Table 3 ffect of p-shifting treatment on the secondary structures of C. esculentusL. protein

注：结果以 ±s表示（n=3）；同列不同字母表示差异显著（P＜0.05）。

pH 相对含量/%α-螺旋 β-折叠 β-转角 无规卷曲3 28.11±0.32a 41.36±0.16f 10.50±0.21a 20.03±0.20a 4 30.48±0.24b 38.82±0.32e 10.52±0.56a 20.18±0.13b 5 31.10±0.26c 38.02±0.23d 10.49±0.22a 20.38±0.17bc 6 32.26±0.19e 36.48±0.29c 10.84±0.25b 20.42±0.24c 7 33.61±0.33f 34.85±0.60b 11.04±0.16b 20.50±0.15a 8 34.15±0.19g 34.59±0.24b 10.94±0.23b 20.52±0.24b 9 34.21±0.21g 33.70±0.17a 11.52±0.19c 20.57±0.23c 10 31.69±0.23d 36.86±0.22c 11.18±0.17b 20.27±0.26c

2.4 粒径分布结果

图3 p值偏移处理对油莎豆蛋白粒径分布及平均粒径的影响Fig. 3 Effects of pH-shifting treatment on the particle size distribution and average particle size of C. esculentus L. protein

粒径是可以间接反映蛋白质结构变化的指标，粒度分布可以充分反映样品溶液中粒子的大小和均匀性。由图3可知，随pH值增加，蛋白粒度分布逐渐从双峰分布转变为单峰分布，表明蛋白质更均匀地分散在溶液体系中[26]。随pH值增加，蛋白的平均粒径在等电点（pH 4.5）附近急剧增大，pH值偏离等电点后，平均粒径逐渐减小。这可能是因为在等电点附近蛋白静电荷为0，分子间作用力减弱，蛋白颗粒间相互碰撞、聚集沉淀，形成聚集体，蛋白分子粒度尺寸因此变大[27]。随pH值增加，平均粒径变小，这可能说明蛋白分子解聚展开，结构变得更加舒展，蛋白溶液体系随pH值增加变得越来越稳定。pH 9以后平均粒径略有上升可能是因为pH值过高导致蛋白变性过度，蛋白分子相互交联产生新的聚集体。

2.5 溶解度分析

图4 p值偏移处理对油莎豆蛋白溶解度的影响Fig. 4 Effect of pH-shifting treatment on the solubility of C. esculentus L. protein

由图4可知，随pH值增加蛋白质溶解度先降低后增加，并在等电点（pH 4.5）附近达到最小值。这可能是因为蛋白和水之间相互作用的减少增强了蛋白分子间的相互作用，导致蛋白质聚集和沉淀，溶解度降低[28]。溶解度随pH值升高而增加是由于蛋白质结构变得更加舒展，蛋白质内部的疏水基团与极性基团暴露出来，附近的结合水增多，促进了蛋白的水化作用，提高了蛋白质的溶解度[29]。同时，油莎豆蛋白颗粒减小，增加了蛋白质颗粒的比表面积，也是溶解度增加的原因之一，该结论与2.2节粒径测量结果一致。此外，有研究表明，pH值偏移处理会导致蛋白质结构展开，同时亚基之间二硫键断裂，有助于溶解度的增加[30]。在pH 9之后溶解度变化趋于平缓，这可能是因为在强碱环境中蛋白严重变性，蛋白质分子重新聚集沉淀。蛋白质溶解度与蛋白质的许多功能特性密切相关，包括其乳化性、凝胶形成能力和形成特性[31]。

2.6 紫外扫描光谱分析

蛋白质产生紫外光谱主要是由于蛋白中的发色基团对紫外光的吸收作用。根据紫外吸收光谱的不同，可以推断出蛋白质三级结构的改变[32]。由图5可知，随pH值增加，紫外吸收强度先降低后增加，且在等电点（pH 4.5）附近达到最小值。这可能是因为在等电点附近蛋白质发生聚集，溶解度达到最小值，影响了发色基团的暴露，从而导致紫外吸收强度降低。但随pH值增加，蛋白构象发生改变，结构更加舒展，发色基团与芳杂环疏水基团更多地暴露，从而引起紫外吸收的增加。蛋白紫外吸收强度的变化说明pH值偏移处理可以诱导蛋白体系构象发生变化，从而引起蛋白质分子微环境的改变。

图5 p值偏移处理对油莎豆蛋白紫外光谱的影响Fig. 5 Effect of pH-shifting treatment on the UV absorption spectrum of C. esculentus L. protein

2.7 荧光光谱分析

图6 p值偏移处理对油莎豆蛋白荧光光谱的影响Fig. 6 Effect of pH-shifting treatment on the fluorescence spectrum of C. esculentus L. protein

内源荧光光谱是检测蛋白构象变化的一种方法，它通过分析光谱变化反映出侧链的变化[31]。间接说明了大豆蛋白三级结构的改变。蛋白的内源荧光主要来自于色氨酸（Trp），分子中苯丙氨酸（Phe）和酪氨酸（Tyr）到Trp残基之间发生了能量转移，导致Phe和Tyr的作用很小，因此油莎豆蛋白的荧光峰实际上是色氨酸残基的荧光峰[33]。由图6可知，不同pH值处理的蛋白荧光光谱形状没有发生改变，但荧光强度发生了明显变化。荧光强度随pH值增加先降低后增加，在等电点附近荧光强度最低。这可能是因为在等电点附近，蛋白分子发生聚合沉淀，使暴露在蛋白分子表面的Trp残基被包裹在蛋白分子内部，导致蛋白荧光强度降低[34]。随pH值增加，蛋白质的氢键、疏水相互作用、静电相互作用等作用力发生改变，蛋白结构变得更加舒展，蛋白内部的Trp残基暴露出来，荧光强度增加。

2.8 浊度分析

为进一步说明pH值偏移引起的蛋白分子聚集以及粒径大小的关系，对油莎豆蛋白的浊度进行测定[34]。由图7可知，随pH值增加，蛋白质浊度先增加后降低，并在等电点（pH 4.5）附近达到最大值。这可能是因为在等电点附近，蛋白净电荷为零，分子间作用力减弱，蛋白颗粒间相互碰撞、聚集沉淀，颗粒较大，导致浊度增加[35]。Renkema等[10]研究发现，在酸性条件下，蛋白质内部疏水基团暴露，并通过疏水相互作用等作用力形成聚集体。碱性条件有利于蛋白质溶解，所以随pH值继续增加，蛋白质溶解度增加，蛋白分子解聚，结构被打开，颗粒变小，浊度降低。

图7 p值偏移处理对油莎豆蛋白浊度的影响Fig. 7 Effect of pH-shifting treatment on the turbidity of C. esculentus L. protein

2.9 表面疏水性分析

图8 p值偏移处理对油莎豆蛋白表面疏水性的影响Fig. 8 Effect of pH-shifting treatment on the surface hydrophobicity of C. esculentus L. protein

表面疏水性是用于评估暴露于蛋白质表面的疏水基团数量的一种方法，通常用于反映蛋白质结构的变化，也与蛋白功能性质有关[36]。由图8可知，随pH值增加，蛋白质表面疏水性先降低后增加，并在等电点（pH 4.5）附近达到最低值，在pH 9之后又有小幅度降低。这可能是因为在等电点附近，蛋白质发生聚集，疏水基团被埋藏在蛋白内部，蛋白质表面疏水性降低。蛋白质表面疏水性随pH值增大而升高是由于蛋白分子解折叠展开，埋藏在蛋白分子内部的疏水基团暴露，ANS荧光探针结合位点增多[37]。pH值增加，表面疏水性增加，荧光强度就越大，这与2.5节荧光光谱分析一致。研究表明，当pH值超过一定范围后，蛋白质的二硫键被破坏，亚基解离，使蛋白质内部的疏水基团暴露，增加其表面疏水性[38]。pH 9之后表面疏水性降低，这可能是因为pH值过高导致蛋白质过度变性，蛋白分子重新聚集，疏水基团被重新包裹在蛋白分子内部[39]。

2.10 EAI及ESI分析

图9 p值偏移处理对油莎豆蛋白乳化性的影响Fig. 9 Effect of pH-shifting treatment on the emulsifying properties of C. esculentus L. protein

由图9可知，随pH值增加，油莎豆蛋白的EAI先降低后增加，并在等电点附近达到最小值。这可能是因为在等电点附近，蛋白质溶解度降低，蛋白分子发生聚集，疏水基团被包裹在分子内部，影响乳化的进行，从而导致蛋白质EAI的降低。杨令叶[40]研究表明，花椒籽仁蛋白pH值在等电点附近时溶解度降低，参与乳化作用的蛋白减少，从而导致EAI降低；Puppo等[41]研究发现，蛋白质的乳化性与疏水性和疏水基团的分布有关。碱性环境中随pH值增加，蛋白质EAI也逐渐增加，这可能是因为pH值升高，颗粒尺寸变小，蛋白结构展开，原本包裹在蛋白分子内部的疏水基团暴露出来，增强其表面活性[42]，导致蛋白EAI升高。

ESI趋势与EAI相似，在等电点处达到最小值。这可能是因为在等电点附近，油水界面吸附蛋白质减少，界面稳定性受到破坏，蛋白质分子易发生聚集，导致蛋白质ESI降低[43]。pH值偏离等电点后，随pH值增加ESI逐渐升高，这可能因为随着pH值增加，蛋白溶解度提高，更多蛋白分子吸附到油水界面，堆积在油滴周围，防止界面稳定性的破坏，从而蛋白质ESI升高。

3 结 论

随pH值升高，油莎豆蛋白的二级结构中β-折叠相对含量降低，α-螺旋、β-转角和无规卷曲相对含量增加。α-螺旋相对含量低可能是因为酸性环境中，蛋白分子间部分电荷发生中和反应，产生静电作用，影响氢键的稳定性。β-折叠相对含量降低可以表明蛋白疏水性增强。蛋白平均粒径在碱性条件下随pH值升高而减小，蛋白粒度分布逐渐从双峰分布转变为单峰分布，表明蛋白质可以更均匀地分散在溶液体系中。通过荧光光谱与紫外光谱分析可知pH值偏移处理使蛋白分子构象发生了改变，在碱性条件下蛋白分子内部多肽链部分展开，疏水基团暴露，蛋白结构变得更加舒展。随pH值增加，蛋白浊度降低，说明蛋白粒子更加分散。蛋白EAI及ESI随pH值增加先降低后增加，表面疏水性也有相同趋势，说明pH值升高，蛋白结构展开，包裹在蛋白分子内部的疏水基团暴露出来，表面活性增强，导致EAI升高，同时蛋白溶解度提高，更多蛋白分子吸附到油水界面，堆积在油滴周围，防止界面稳定性的破坏，蛋白质ESI升高。