miR-520a-3p靶向Nek2对胶质瘤细胞增殖、迁移及侵袭的影响

卢荣加 王建华 江常震

(1福建中医药大学附属龙岩人民医院神经外科，福建 龙岩 364100；2福建医科大学附属第一医院神经外科)

胶质瘤是中枢神经系统中常见的原发性恶性肿瘤，当前仍采用以手术为主的综合治疗手段〔1〕。但因为其浸润性生长的特性，手术全切困难〔2〕；且肿瘤的异质性较强，容易对放化疗不敏感，致残率及致死率高，探索其发生发展机制、寻找更为有效的治疗策略对治疗胶质瘤具有重要意义〔3〕。分子靶向治疗在胶质瘤中的应用逐渐引起关注〔4〕。miRNA与脑胶质瘤的发生、发展密切相关，可作为脑胶质瘤临床诊断、预后评估的新指标及治疗的新靶点〔5〕。研究发现，miR-520a(3p)基因多态性与原发性高血压相关联〔6〕；miR-520a-3p与骨肉瘤〔7〕、结直肠癌〔8〕、非小细胞肺癌〔9〕的发生发展相关。但miR-520a-3p对胶质瘤细胞的调控机制尚未清楚，本实验探讨miR-520a-3p如何影响胶质瘤的增殖、迁移和侵袭等行为。

1 材料与方法

1.1材料 胶质瘤细胞U251、T98G和正常人星形胶质细胞NHA(中国科学院上海细胞库)；RPMI1640培养基(美国Gibco公司)；四甲基偶氮唑蓝(MTT)试剂盒(美国Sigma公司)；Annexin V-FITC/PI试剂盒、双荧光素酶报告基因检测试剂盒(北京索莱宝科技有限公司)；荧光定量试剂盒(日本TaKaRa公司)；Transwell小室、Matrigel(美国BD公司)；RIPA蛋白裂解液、十二烷基硫酸钠(SDS)-聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)试剂盒(上海碧云天生物技术有限公司)。

1.2方法

1.2.1细胞培养与分组 胶质瘤细胞U251、T98G和正常人星形胶质细胞NHA使用含10%胎牛血清的RPMI1640培养基培养；取处于对数生长期的细胞U251、T98G，将其分为miR-NC组(转染miR-NC)、miR-520a-3p组(转染miR-520a-3p mimics)、si-NC组(转染si-NC)、si-NEK2组(转染si-NEK2)、anti-miR-NC组(转染anti-miR-NC)、anti-miR-520a-3p组(转染anti-miR-520a-3p)、pcDNA3.1-NEK2+ miR-520a-3p组(共转染pcDNA3.1-NEK2和miR-520a-3p)。

1.2.2MTT检测细胞增殖 各组细胞培养至24 h、48 h、72 h时，按试剂盒说明操作，酶标仪检测490 nm处吸光度(OD)值。

1.2.3Transwell检测细胞迁移和侵袭 用无血清培养基重悬细胞；细胞迁移实验：Transwell小室上室加200 μl 细胞悬液，培养24 h，擦去小室上层细胞，磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤后用甲醛固定，再用结晶紫染色，显微镜观察并拍照，计算迁移细胞数。细胞侵袭实验：Matrigel铺于Transwell小室上室，干燥后同细胞迁移实验。

1.2.4流式细胞术检测细胞凋亡 收集各组细胞，依试剂盒说明书操作，上流式细胞仪检测细胞凋亡情况。

1.2.5实时定量聚合酶链反应(qRT-PCR)检测miR-520a-3p表达水平 提取总RNA后反转录成cDNA，按照荧光定量试剂盒说明操作，然后进行qRT-PCR，相对表达量采用2-△△Ct法计算。

1.2.6Western印迹检测蛋白表达 提取细胞总蛋白后检测蛋白浓度，而后进行SDS-PAGE，转至聚偏氟氯乙烯(PVDF)膜，封闭后加入一抗4℃孵育过夜，然后加入二抗室温孵育2 h，显影、定影，用Quantity One分析蛋白条带吸光度，计算蛋白表达水平。

1.2.7荧光素酶报告基因检测实验检测miR-520a-3p对NEK2的靶向调控 构建NEK2 3'UTR的野生型和突变型荧光素酶表达载体(WT-NEK2和MUT-NEK2)，将其与miR-520a-3p共转染至胶质瘤细胞；依试剂盒说明检测荧光素酶活性。

1.3统计学分析 采用SPSS20.00软件进行t检验、单因素方差分析。

2 结 果

2.1miR-520a-3p在胶质瘤细胞U251、T98G和正常人星形胶质细胞NHA中的表达 与NHA组细胞(1.18±0.06)相比，U251(0.63±0.04)、T98G(0.38±0.02)组细胞中miR-520a-3p的表达水平均显著下降，差异均有统计学意义(均P<0.05)。可见，miR-520a-3p在胶质瘤细胞中下调表达。

2.2miR-520a-3p过表达对胶质瘤细胞U251、T98G增殖、凋亡的影响 与miR-NC组相比，miR-520a-3p组胶质瘤细胞U251、T98G中miR-520a-3p表达水平升高，Bcl-2蛋白的表达水平降低，Bax蛋白的表达水平升高，细胞活性降低，凋亡率升高(P<0.05，图1，表1，表2)。

2.3miR-520a-3p过表达对T98G细胞迁移、侵袭的影响 与miR-NC组相比，miR-520a-3p组T98G细胞中MMP-2蛋白的表达水平降低，E-cadherin蛋白的表达水平升高，迁移和侵袭的T98G细胞数量降低(P<0.05)，图2，见表3。

1，3：miR-NC组；2，4：miR-520a-3p组图1 miR-520a-3p对胶质瘤细胞U251、T98G凋亡及凋亡蛋白的影响

表1 过表达miR-520a-3p对U251细胞增殖、凋亡的影响

表2 过表达miR-520a-3p对T98G细胞增殖、凋亡的影响

图2 miR-520a-3p过表达对T98G细胞迁移、侵袭蛋白表达的影响

表3 miR-520a-3p过表达对T98G细胞迁移、侵袭的影响

2.4miR-520a-3p靶向调控NEK2 TargetScan预测到NEK2与miR-520a-3p存在结合位点(图3)。T-NEK2和miR-520a共转染后细胞荧元素酶活性低于WT-NEK2和miR-NC共转染后的细胞(0.35±0.01 vs 1.11±0.04，t=45.151,P<0.05)；MUF-NEK2和miR-520a-3p共转染后细胞荧光素酶活性与MUT-NEK2和miR-NC共转染后的细胞无显著差异(1.14±0.05 vs 1.18±0.04，t=1.530,P>0.05)。过表达miR-520a-3p NEK2表达水平(0.15±0.01)较miR-NC组明显降低(0.98±0.09，P<0.05)；抑制miR-520a-3p表达，NEK2表达水平(1.87±0.09)较anti-miR-NC组明显升高(0.93±0.04，P<0.05)，见图4。

图3 miR-520a-3p靶向调控NEK2

1～4：miR-NC组,miR-520a-3p组,anti-miR-NC组,anti-miR-520a-3p组图4 NEK2蛋白的表达

2.5抑制NEK2表达对T98G细胞增殖、凋亡、迁移、侵袭的影响 与 si-NC组相比，si-NEK2组T98G细胞中NEK2、Bcl-2、MMP-2蛋白的表达水平均显著降低(P<0.05)，Bax、E-cadherin蛋白的表达水平均显著升高(P<0.05)，T98G细胞活性显著降低(P<0.05)，T98G细胞迁移和侵袭数量显著降低(P<0.05)，T98G细胞的凋亡率显著升高(P<0.05)，见表4，表5，图5。

表4 抑制NEK2表达对T98G细胞凋亡、迁移、侵袭蛋白表达的影响

表5 抑制NEK2表达对T98G细胞增殖、凋亡、迁移、侵袭的影响

图5 NEK2、凋亡及侵袭蛋白的表达

2.6过表达NEK2能逆转miR-520a-3p对T98G细胞增殖、凋亡、迁移、侵袭的作用 与miR-520a-3p+pcDNA3.1组相比，miR-520a-3p+pcDNA3.1-NEK2组细胞中NEK2、Bcl-2、MMP-2蛋白表达水平显著升高(P<0.05)，Bax、E-cadherin蛋白表达水平显著降低(P<0.05)，细胞活性显著升高(P<0.05)，细胞迁移和侵袭数量显著升高(P<0.05)，细胞凋亡率显著降低(P<0.05)，见图6，表6，表7。

1～4：miR-NC组,miR-520a-3p组,miR-520a-3p+pcDNA3.1组,miR-520a-3p+pcDNA3.1-NEK2组图6 NEK2、凋亡及侵袭蛋白的表达

表6 过表达NEK2对NEK2、凋亡、迁移、侵袭蛋白表达的影响

表7 过表达NEK2能逆转miR-520a-3p对T98G细胞增殖、凋亡、迁移、侵袭的影响

3 讨 论

胶质瘤发病率和死亡率较高，因其耐药机制的限制，无法发挥放疗及化疗原有的治疗效果〔9,10〕。miRNA参与了肿瘤增殖、凋亡、转移、血管生成、免疫应答等过程〔11〕。miR-520a属于人miR-520家族，该家族定位于人第19号染色体上〔12〕。研究发现，上调miR-520a-3p可抑制骨肉瘤MG63细胞的增殖和迁移，促进细胞凋亡〔7〕。miR-520a-3p可以通过靶向表皮生长因子受体(EGFR)抑制细胞迁移，促进细胞凋亡，导致结直肠癌细胞周期停滞在G0/G1阶段，减缓异种移植小鼠中肿瘤的生长〔8〕。miR-520a-3p通过靶向MAP3K2〔13〕、HOXD8〔14〕抑制非小细胞肺癌的增殖、凋亡和转移；miR-520a-3p在肺癌干细胞中低表达，通过调控MAP3K2基因表达，诱导CD133+肺癌干细胞凋亡〔15〕。miR-520家族通过靶向核因子(NF)-κB和肿瘤生长因子(TGF)-β信号通路抑制乳腺癌的转移侵袭〔16〕。miR-520a可调控ErbB4的表达并抑制食管鳞癌细胞的增殖与侵袭〔17〕。miR-520a-5p 靶向调控STAT3诱导细胞凋亡并抑制K562白血病细胞增殖〔18〕。miR-520a通过抑制AKT表达抑制HaCaT细胞的增殖和有丝分裂〔19〕。本研究发现，miR-520a-3p在胶质瘤细胞中低表达，过表达miR-520a-3p可抑制胶质瘤细胞增殖、迁移和侵袭，促进细胞凋亡，还可靶向调控NEK2的表达。

NEK2是一种定位于中心体的细胞周期调节蛋白激酶〔20〕。NEK2在恶性胶质瘤中显著上调，对恶性肿瘤的发生发展中起着重要的作用，其表达量与胶质瘤的恶性程度呈正相关〔21〕。NEK2在肺癌中异常高表达，可作为肺癌早期检测及患者预后的生物标志物〔22〕。NEK2在乳腺癌中高表达，参与了乳腺癌的形成过程〔23〕；也是治疗乳腺癌的分子靶标〔24〕。沉默NEK2可抑制卵巢癌SKOV3细胞的侵袭〔25〕；NEK2的上调与卵巢癌中的耐药性相关〔26〕。抑制NEK2表达可抑制胆管癌细胞增殖，诱导细胞死亡〔27〕。NEK2受miR-128的调节，其上调表达与结直肠癌的预后不良有关〔28〕。NEK2可通过MAPK信号通路调节HepG2细胞的增殖，凋亡〔29〕。MBM-5可有效抑制NEK2的激酶活性，抑制胃癌肿瘤生长〔30〕。miR-195负调控NEK2的表达，抑制前列腺癌细胞的增殖〔31〕。miR-486-5p负调节NEK2，NEK2高表达促进肝癌细胞系的增殖，集落形成，迁移和侵袭〔32〕。本研究发现，抑制NEK2表达可抑制胶质瘤T98G细胞增殖、迁移和侵袭，促进细胞凋亡。过表达NEK2能逆转miR-520a-3p对胶质瘤细胞T98G增殖、迁移侵袭的抑制和凋亡的促进作用。