基于网络药理学的蛹虫草活性成分抗炎症作用的药效机制

窦瑶 魏琳 宋伍 孙聪 王宏英 王卫芳 郭艳霞 阎慧 郭寰宇 梁雪娇 毛璐 周晓晶

(长春中医药大学 1临床医学院，吉林 长春 130117；2药学院)

蛹虫草又名北冬虫夏草、北虫草、蛹草。属子囊菌门、肉座菌目、虫草菌科、虫草属(Cordyceps)〔1〕，与冬虫夏草为同属异种。蛹虫草与冬虫夏草具有几乎相同的药用成分〔2〕，其中活性成分如虫草素、虫草酸、虫草多糖、氨基酸、维生素、微量元素和超氧化物歧化酶等的含量比冬虫夏草还要高，且蛹虫草生长较快易于人工培养，作为虫草属的模式种，目前已广泛被国内外科研人员所认知和接受并成为科学研究的热点，蛹虫草已逐渐成为冬虫夏草的理想替代品。在《全国中草药汇编》中已有记载：“蛹虫草(北虫草)的子实体及虫体也可作为冬虫夏草入药。”我国的《中华人民共和国药典》把蛹虫草的药理功效归纳为补肺益肾、止咳化痰。用于慢性支气管炎症属肺肾气虚、肾阳不足者；症见咳嗽气喘、咯痰、自汗、恶风、易感、身寒肢冷、腰酸肢软、乏力、头昏耳鸣等。无论是古代药书中对虫草“止血化痰，治诸虚百损”的记载还是现代《药典》中对蛹虫草药效的归纳，在蛹虫草的多种药理作用中，抗炎症作用已成为目前国内外的科研热点。

炎症是威胁人类健康的一种常见病和多发病。从一方面来说，炎症是有利于机体的防御反应。但炎症反应对人体也存在重大威胁，过度的炎症反应可能致伤致残甚至危及生命。目前，每年全球约有8 500万慢性炎症患者和 193 万急性炎症患者都承受着病痛的困扰〔3〕。最新研究表明，炎症已经与肿瘤的发生联系起来〔4〕。因此，炎症是医学研究中最原始、最复杂又最具挑战的新课题。

蛹虫草的活性成分虫草素即3′-脱氧腺苷，是第一个从真菌中分离出来的核苷类抗菌素。虫草素具有抗肿瘤、抗菌、抗病毒、免疫调节、清除自由基等多种药理作用〔5〕。以虫草素为主要成分的新药已临床上试用于白血病的治疗，有良好的临床应用前景〔6〕。虫草酸，即D-甘露醇，是虫草的主要有效成分之一。蛹虫草中的虫草酸含量要高于天然的冬虫夏草〔7〕。虫草酸具有利尿脱水、提高血浆渗透压、镇喘祛痰等药理作用。在临床上可用于血管痉挛、脑血栓、抗氧化、利尿脱水、镇咳、祛痰平喘、肾衰竭的治疗〔8〕。然而蛹虫草的这两种活性成分在炎症作用发挥的药效机制尚不清楚。

网络药理学可通过对多种复杂网络及多水平相互连接的分析阐述中药多成分、多靶点的潜在作用及作用机制，可通过系统观察药物对生物网络的干预与影响，揭示中药整体调控的药效机制〔9〕。

本研究基于网络药理学的原理，构建蛹虫草活性成分虫草素和虫草酸抗炎症作用蛋白质互作网络。并依据该网络，以脂多糖诱导的RAW264.7细胞为模型，在确立虫草素和虫草酸合适的干预浓度和时间后，对在互作网络中筛选到的关键节点蛋白质的基因表达情况进行分析。以期从多成分、多靶点整合作用的角度，揭示蛹虫草的抗炎症作用机制。

1 材料与方法

1.1化学结构研究 通过PubChem数据库分别检索蛹虫草的活性成分虫草素和虫草酸的2D、3D结构，随后下载并保存2D和3D结构的SDF格式文件。

1.2虫草素和虫草酸作用靶点和炎症作用靶点研究 将获得的蛹虫草活性成分虫草素和虫草酸的化学结构(2D结构和3D结构)的SDF格式文件导入pharmmapper数据库，预测虫草素和虫草酸的作用靶点。随后通过Uiprot、Pubme等数据库对获取的化合物作用靶点名称进行矫正。

Genecards是一个以基因为中心的数据库，每个人类基因都有一个网页。 以炎症“inflammation”为关键词进行检索并下载有关的全部基因。使用“Venny”将化合物作用靶点与炎症作用靶点取交集得到化合物抗炎靶点，用于后续研究。

1.3活性化合物-靶点网络和靶点-疾病网络的构建 通过Cytoscape3.2.1软件将虫草素和虫草酸靶点和抗炎症作用靶点，构建虫草素和虫草酸抗炎症靶点网络图，初步探究虫草素和虫草酸对抗炎的药理作用和机制。

1.4蛋白互作(PPI)网络的构建 为了研究靶点蛋白在系统水平上的相互作用，确定化合物作用靶点群，将化合物治病靶点基因上传至在线STRING10.5软件，构建由导入基因表达产物组成的PPI网络，并且利用Origin9.1软件对PPI网络中的蛋白绘制条形图。

1.5基因本体论(GO)功能富集和京都基因与基因组百科全书(KEGG)通路富集分析 本研究采用David v 6.8 数据库对1.4的靶点进行GO功能富集分析和KEGG通路富集分析。从通路分析来阐释药对生物学角度的科学内涵。

1.6互作网络中筛选到的8个关键节点蛋白质的基因表达情况分析 首先以1 μg/ml脂多糖(LPS)诱导的RAW264.7细胞24 h构建炎症反应模型，然后设置浓度梯度确立虫草素和虫草酸对细胞合适的干预浓度，设定的虫草素和虫草酸干预浓度为12.5 μmol/L、25.0 μmol/L、50.0 μmol/L，并设置干预时间分别为24 h、48 h。同时以赖氨匹林(100 mg/kg)干预LPS诱导后RAW264.7细胞24 h和48 h作为阳性对照。提取上述处理细胞的总RNA，并在此基础上利用qRT-PCR方法对在互作网络中筛选到的8个信号转导通路中的关键节点蛋白质的基因表达情况进行分析。

2 结 果

2.1收集蛹虫草活性成分虫草素和虫草酸的相关靶点 通过将虫草素和虫草酸的2D和3D化学结构导入pharmmapper数据库和ChEMBL数据库预测虫草素和虫草酸作用靶点。收集到虫草素的靶点蛋白质共有91个：PRIM1、GPI、CRKL、MAGI1、MSH2、NUB1、ERBB2、TTR、SLC30A9、RNF8、PCNA、CPA1、CSNK1G1、RBKS、HHEX、ALDH3A1、RRM1、RAN、NLGN1、SMURF2、MDH2、EXTL2、NR1I3、VEGFA、MTA3、NUDT4、SSB、CPB2、PATJ、CD3E、GSS、PUS10、PLK4、SULTA4A1、SRP19、MICA、STAT5A、P4HB、SMG7、ACTR3、DPP4、CA14、PROC、FLNB、OLA1、SEPSECS、SACS、EWSR1、PTPRD、LPA、BPHL、ZCWPW1、RAB26、PA2G4、F2、POU1F1、ARF6、SKP1、UBTF、SWAP70、NCR1、ACAD11、TOM1、EIF5A、ACTA1、SEC13、B2M、ARSA、RAP1GAP、CDKN1B、SORCS2、POU2F1、DNAJC16、APR6、ALB、RNASE1、BBX、THOC1、UBE3A、PCYT2、GSTM1、GARS、DHPS、TLR4、ERK1、PTGS2/COX2、MAPKP38、NOS、IL6、NFKB1、TNF；虫草酸靶点蛋白质共82个：ACTR3、PRIM1、TNFRSF1A、ZKSCAN5、QPRT、CPB2、CRDL、HTATIP2、PATJ、MAGI2、NCAM1、SEC13、RINS2、NUB1、TTR、CYP2C8、PPAT、GSTM4、RRM1、SRR、CNTN2、GDI1、SLC30A9、NCR1、MSH2、LOX、PRDM4、MUS81、SH3BGRL、FLNB、CYB5A、PAX5、IGFBP1、EIF5A、RPL9、CDKN1B、COTL1、SDK2、SAP18、DAPK2、ACTA1、CPM、ATP6V1A、TRAF4、OGG1、GALK1、GPI、NR1I3、ARHGAP21、PLK4、EXTL2、MDH2、MDH1、POU2F1、CNN2、WNK1、CNKSR1、ELOF1、EPS8L2、TXNL4B、VRK2、COL20A1、PPP1CB、HNF1B、DLD、CD3E、SKPQ、ESRRB、DAAM1、GAD2、GDA、TP63、TOM1、RBKS、TLR4、ERK1、PTGS2/COX2、MAPKP38、NOS、IL6、NFKB1、TNF。

2.2挖掘到抗炎症作用相关靶点的蛋白质 以“inflammation”为关键词在 Genecards数据库进行检索并下载有关的全部基因，共获得9 000多相关基因。使用“Venny”将化合物作用靶点与炎症作用靶点取交集得到虫草素和虫草酸的抗炎靶点86个，用于后续研究。

2.3构建蛹虫草活性成分虫草素和虫草酸的抗炎症作用靶点的PPI网络 依据String数据库中检索到的虫草素/虫草酸抗炎症作用靶点的PPI数据信息，导入PPI网络可视化软件Cytoscape3.6.0，对每个靶点的PPI数据进行计算，去掉数据重复信息，构建复杂的蛹虫草活性成分虫草素和虫草酸的“药物活性成分-靶点-疾病蛋白网络”即与抗炎症作用-网络。见图1。

2.4虫草素/虫草酸抗炎症作用靶点的通路富集分析 对虫草素/虫草酸抗炎症作用靶点进行GO功能富集分析和KEGG通路富集分析发现，这些靶点分布在35条通路当中，根据P>0.01筛选出26条(见表1)，其中KEGG通路通过查看基因在通路中的分布情况，可以了解该基因在代谢、信号转导等通路中的作用。

图1 虫草素和虫草酸抗炎症作用靶点的PPI网络

表1 虫草素和虫草酸抗炎症作用靶点的通路富集分析

2.5选取蛹虫草活性成分虫草素和虫草酸的抗炎症作用靶点的PPI网络中关键节点 依据蛹虫草活性成分虫草素和虫草酸的抗炎症作用的PPI网络及网络中的GO和KEGG分析数据，结合抗炎症作用关键的细胞信号转导通路，选择蛹虫草活性成分虫草素和虫草酸在炎症作用中的关键作用蛋白质8个：TLR4、ERK1、COX-2、P38、iNOS、IL-6、NF-κB、TNF-α。

2.6通过细胞水平的实验探究蛹虫草介导多条信号转导通路的抗炎症作用药效机制 虫草素和虫草酸干预24 h后与阳性对照(抗炎症药物赖氨匹林100 mg/kg)相比，8个关键靶点蛋白均明显下调。其中，COX-2、ERK1、iNOS、TNF-α 4个靶点蛋白虫草酸干预24 h后比虫草素干预24 h后下调更明显；IL-6、TLR4 2个靶点蛋白虫草酸干预24 h后与虫草素干预24 h后无明显区别；P38虫草素干预24 h后比虫草酸干预24 h后下调更为明显；NF-κB虽然在虫草素和虫草酸干预24 h后也表达下调，但NF-κB表现为对虫草素和虫草酸浓度更加敏感，低浓度虫草素/虫草酸和中浓度的虫草酸干预24 h后NF-κB表达下调更加明显，中、高浓度虫草素和高浓度虫草酸干预24 h后反而表达上调。虫草素和虫草酸干预48 h后与阳性对照(抗炎症药物赖氨匹林100 mg/kg)相比，明显表达下调的靶点蛋白包括：ERK1、iNOS、P38、TLR4、TNF-α、NF-κB；明显表达上调的靶点蛋白包括：COX2、IL6。虫草素和虫草酸干预24 h后的靶点蛋白表达情况更有分析意义。见图2。

3 讨 论

尽管抗炎症作用的机制还有待探讨，本研究采用网络药理学筛选出蛹虫草活性成分虫草素和虫草酸抗炎症作用的86个靶点蛋白。通过活性成分-靶点-疾病网络特征分析，构建了靶点蛋白的互作网络，并将靶点蛋白富集在26条信号通路中，如NF-κB信号转导通路，NF-κB是前炎症因子基因表达调节的关键成分之一，诱导前炎症细胞因子、趋化因子、黏附分子等表达〔10〕。NF-κB在多种炎症性疾病的炎症部位高度活化，如类风湿关节炎、炎症性腹泻、多发性硬化症、哮喘等〔11〕。受体蛋白TLR是动物体与生俱来的一类免疫蛋白，在非特异性免疫过程中起到至关重要的作用〔12〕，其受体蛋白为TLRs。TLRs完成了非特异性免疫的最初识别步骤的同时也可介导LPS诱发的多种细胞反应的中间受体，其活性与表达程度直接决定了巨噬细胞的激活程度〔13，14〕。TLR信号转导通路富集到的4个靶点蛋白在肠炎信号通路、肺结核信号通路、类风湿关节炎信号通路，这3条炎症相关信号通路中同样被富集，说明这些靶点蛋白为多种炎症疾病的共同调控因子。TNF信号转导通路中富集了3个关键靶点蛋白(IL6、TNF-α、NFKB)，其中TNF-α是一种参与免疫应答的细胞因子，还是一种重要的炎症介质，TNF-α还对肿瘤细胞有细胞毒性、细胞溶解、抑制增殖等作用〔15〕。说明炎症与肿瘤之间存在密切联系。

综上，蛹虫草的有效成分通过上述靶点相互作用，实现其抗炎等作用。本研究结果为进一步阐释蛹虫草抗炎症作用的药效机制奠定了理论基础，也为后续的实验研究提供了科学依据。