水产品中扑草净气质联用检测方法及基质效应的研究

桂英爱，葛祥武，孙程鹏，丁 勇

( 1.大连市检验检测认证技术服务中心，辽宁 大连 116037； 2.大连市现代农业生产发展服务中心，辽宁 大连 116023 )

扑草净，化学名称为4,6-双异丙胺基-2-甲硫基-1,3,5-三嗪，是均三氮苯类内吸传导选择性除草剂，分子式为C10H19N5S，分子量241.36。近年来，除了在农业生产中广泛作为稗草、马齿苋、车前草等1年生禾本科及阔叶草的除草剂外，还在水产养殖业中作为环境改良剂清除鱼、虾、蟹、贝、海参等养殖水体中的丝状藻类(青苔)、大型草类及有害藻类。由于大面积及不合理使用，扑草净通过吸附迁移及食物链等造成了生态环境和相关产品中的残留。2012年4月—2019年7月，我国出口的水产加工品和鲜品有几十个批次被日本检出(为一律基准10 μg/kg)含有扑草净，作废弃销毁处理[1-2]，给中国水产品出口企业带来了极大的经济损失。水产品对扑草净的富集能力较强，如在海水暴露质量浓度为1 μg/L的情况下，文蛤(Meretrixmeretrix)对扑草净的最大富集系数达到22.9[3]，说明监控水产品中扑草净残留量的重要性。所以当务之急需要尽快摸索出高效、快捷的适用检测方法。

迄今，国内外已有诸多对扑草净检测方法的报道，有气相色谱法、气质联用法及液质联用法等，其中以气质联用法最多，主要涉及水体[4]、土壤[5]和海产品[6-7]等。由于扑草净分子2个侧链具有R-NH-特征的特殊结构极易产生基质效应，导致测量数据中的样品信号可能与纯组分不同，通过常规的外标校准法对这样的信号进行量化可能产生不可靠的结果，在气质检测过程中这种基质增强效应极大地影响了结果的准确性和定量，在低含量时表现尤为明显，而产品中扑草净检测的技术关键是在一律基准质量浓度10 μg/kg处能够精准定量。因此，分析方法建立时，必须考察样品的基质效应及定量限附近的结果。有多篇文献提到了扑草净的基质效应及采取的措施，如朱晓华等[8]采用固相萃取—气质串联法检测水产品扑草净时，严格匹配了各种基质，并采用基质匹配校准法和用内标法纠正回收率和系统误差增大的现象；Garrido等[9]采用标准加入法对潜在的可能超过最大允许残留量水平的阳性样品进行了准确的定量，并同时监测2～3个特征离子筛选鉴别潜在的非负性样品；Hernndez Torres等[10]通过溶液校准和基质匹配校准曲线的斜率和截距进行配对比较，采用校正函数对基质影响的不确定度进行了描述。Stüber等[11]测试了3种不同的校准方法(内标法、外标法和基质匹配校准法)补偿样品中基体效应，并与标准加入法进行比较，认为高度复杂的样品，3种方法都不能得到与标准加入法相当的可靠数据。因此标准加入法提供了最精确的结果，是补偿高负载样品中基质效应有效的量化方法。

笔者在以上研究的基础上，进一步探索了扑草净的气质联用检测、基质效应、复杂基质样品的处理和假阳性的排查等方法，为开展仿刺参(Apostichopusjaponicus)、菲律宾蛤仔(Ruditapesphilippinarum)等水产品中的扑草净含量检测提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 样品来源

仿刺参和菲律宾蛤仔样品均购自大连市市场。

1.1.2 主要仪器与试剂

7890A-5975C型气相色谱—质谱联用仪(美国Agilent公司)；SQP电子天平，感量0.01 g(赛多利期科学仪器公司)；BS224S天平，感量0.1 mg(赛多利期科学仪器公司)；N-EVAPTMⅢ氮吹仪(Organomation公司)。

扑草净标准品(德国Dr公司，纯度大于98.0%)；乙腈、丙酮和正己烷均为色谱纯；无水硫酸钠(分析纯)，550 ℃烘4 h，冷却后装瓶于干燥器中密封保存；Envi-Carb/LC-NH2固相萃取柱500 mg/500 mg×6 mL(Supelco公司)。

1.2 方法

1.2.1 仪器条件

色谱：毛细管色谱柱DB-5MS(30 m×0.25 mm×0.25 μm)；柱温程序升温条件：初始温度50 ℃以10 ℃/min升至150 ℃保持0.50 min，然后以30 ℃/min升至213 ℃，以30 ℃/min升至280 ℃保持2 min；进样口温度：280 ℃；进样方式为不分流进样；载气为高纯氦气(99.999%)，流速1.0 mL/min；进样量1 μL。

质谱：电子轰击离子源(EI)；四极杆温度150 ℃；离子源温度为230 ℃；传输线温度280 ℃；电离能量70 eV。测定方式为40～480分子量全扫描(SCAN)和选择离子扫描(SIM)；溶剂延迟时间为5.00 min，监测离子时间为5.00～21.93 min。

1.2.2 标准曲线配制

准确称取扑草净标准品0.0100 g，用正已烷溶解，定容于100 mL容量瓶中，配制成质量浓度为100 μg/mL的标准储备溶液，再用正已烷稀释成相应质量浓度的工作混合溶液。

(1)采用正已烷作为溶剂配制质量浓度为0、0.005、0.01、0.02、0.04、0.10、0.20、1.0 μg/mL的扑草净系列标准溶液，得到扑草净标准曲线。

(2)向空白仿刺参样品中分别添加不同浓度的扑草净标准溶液，使添加水平为0、5.0、10、20、40 μg/kg和100 μg/kg，样品提取过程见1.2.3，得到基质校准曲线。

1.2.3 样品前处理

样品提取主要参照文献[8]方法。以仿刺参为例，准确称取2.00 g已匀浆的试样于100 mL离心管中，加入30 mL乙腈溶剂超声30 min，4000 r/min的转速离心10 min，取上清液通过无水硫酸钠的漏斗于250 mL鸡心瓶中，再重复用10 mL乙腈提取1次，合并提取液于同一个鸡心瓶中，于40 ℃水浴中旋转蒸发至干燥，残渣用2 mL正己烷溶解，备用。

将ENVI-Carb/LC-NH2固相萃取柱依次用3 mL丙酮和3 mL正己烷活化。转移浓缩的样品溶液至柱子中，再用3 mL正己烷清洗瓶子并过柱，过完后抽干。以5 mL正己烷∶丙酮(体积比为6∶4)的混合液分2次以1 mL/min流速过柱洗脱，收集全部洗脱液至10 mL小试管中，氮吹仪缓慢吹干。用1 mL正己烷定容，供气相色谱—质谱分析检测。

2 结果与分析

2.1 色谱图

数据采集模式：在1.2.1色谱及质谱条件下，得到扑草净标准溶液全扫描质谱图(图1)，选择相对丰度高的4个特征离子241(100%)，184(85%～90%)，226(60%～65%)和199(22%～25%)，以m/z241作为扑草净的定量离子。

2.2 线性方程、基质效应和检出限

扑草净标准溶液在0.005～1.0 μg/mL浓度线性范围内曲线回归方程为y=11 658x-2.78，r2=0.9994(图2)和在0.010～0.2 μg/mL质量浓度线性范围内标准加入法工作曲线为y=21 189x-1.90，r2=0.9984。以提取前加标峰面积/扑草净在溶剂中峰面积评价基质影响[12]。两者斜率比超出80%～120%[13]，达到145%，这与Rodríguez-Gonzlez等[14]的129%～142%相近。说明存在比例误差，相比系统误差[10]可以忽略，有明显的基质增强效应，需要采取相应的基质补偿措施。

结合表1结果，在回收率和精密度满足残留检测要求的前提下，根据3倍信噪比计算检出限4 μg/kg ，定量限(10 S/N)为10 μg/kg亦为基准含量值，比Chae等[15]的定量限40 μg/kg还要低，可以满足日本对我国水产品出口的扑草净限量要求。

2.3 加标回收率和精密度

在2.00 g空白仿刺参样品中分别添加10、20和100 μg/kg 3个水平的扑草净，每个水平设6份加标平行样，应用标准加入法计算的回收率为99.6%～112.6%(表1)，精密度分别为15.4%、9.0%和2.0%。

图1 扑草净标准全扫描质谱图及谱库检索结构式Fig.1 Standard full scan mass spectrum and library search structure of prometryn

图2 不同水平扑草净标准溶液响应Fig.2 Responses of the different standard solution of prometryn

表1 仿刺参中扑草净3个添加水平加标回收率和精密度(n=6)Tab.1 Spike recovery rate and precision of prometryn in sea cucumber at 3 doses

试验中发现检测含量越低，精密度越差，基质干扰越严重，但是在定量限10 μg/kg处可以满足检测要求。由图3～4可见，同时对500 μg/kg高水平添加扑草净样品进行全扫描，得到4个监测离子241、184、226和199的理论丰度比符合扑草净的定性要求，经谱库检索吻合度达99%，与标准品出峰时间15.507 min一致，说明目标物就是扑草净。

2.4 样品定量中假阳性的判断

菲律宾蛤仔样品经其他固相萃取柱净化得到的色谱图见图5，出峰时间和扑草净标准完全一致(15.508 min)，但是监测特征离子对184/241的比例和标准溶液184/241离子对85%～90%比例相比远超过20%的偏差，可见样品峰为干扰物质不是目标物，判定为假阳性。

2.5 实际样品测定

分别抽取22个菲律宾蛤仔和12个仿刺参样品按以上试验条件进行测定，同时采用标准加入法和结合标准溶液曲线进行定量，有1个菲律宾蛤仔样品信号较强。选取此样品重新进样，同时选定2个特征离子(241和184)，结果表明184/241离子比例为85.3%，在85%～90%内，符合<20%的相对偏差要求(图6)，确认是扑草净组分但经计算其含量低于10 μg/kg限量值。其他33个菲律宾蛤仔和仿刺参样品未检出扑草净，产品质量也同样满足企业出口要求。

图3 未知样品(上)和仿刺参加标样品20 μg/kg(下)TIC图Fig.3 TIC diagrams of unknow samples (top) and spiked samples (bottom) in sea cucuber exposed to 20 μg/kg

图4 仿刺参加标样品提取离子流图Fig.4 Ion current diagram of standard sample extraction in sea cucumber

图5 菲律宾蛤仔假阳性样品的TIC色谱图和提取离子流图Fig.5 TIC diagram and extracted particle flow diagram of false positive samples in Manila clam

图6 菲律宾蛤仔实际样品的测定及定性结果(保留时间15.404 min)Fig.6 Determination and qualitative results of actural samples (retention time=15.404 min)

3 讨 论

3.1 样品处理方法及进样条件的选择

线性方程的稳定性：由于仪器状态如进样口、色谱柱、检测器等随时间发生变化，表现在每批扑草净标准溶液曲线法及标准加入法的响应值和线性方程都有差异，不同进样时间段的保留时间也会有所偏移，所以需要在同一设备同一色谱质谱方法条件下保证标准和样品同时进样比较才能实现定量的准确性。

本试验先后采用了乙酸乙酯、正已烷和乙腈做为提取溶剂，乙酸乙酯提取溶液颜色较深，含部分色素，而正已烷颜色虽浅但是共萃取的脂类杂质较多，均对结果产生了干扰，增加了净化的复杂性，而用乙腈溶剂提取则干扰少峰形好而且提取效率高。

由于水产品中基质成分复杂，含大量的脂肪、蛋白质和色素等大分子物质，如果样品处理不好，将直接影响后续的定性和定量。本试验采用了常用的弗罗里硅土柱、N-丙基乙二胺(PSA)柱和ENVI-Carb/LC-NH2柱联用等进行净化试验，发现用弗罗里硅土柱净化回收率较高，超过90%，但是除色素能力没有ENVI-Carb/LC-NH2柱联用高。PSA填料是极性吸附剂，有2个氨基，具有一定的阴离子交换能力，单独使用可去除部分杂质但净化不够彻底。ENVI-Carb碳黑填料去除产品色素功能强大，而氨基Amino-NH2柱属正相萃取柱适合极性化合物，弱阴离子交换萃取，ENVI-Carb/LC-NH2柱联用使洗脱液呈透明色，净化效果好，在谱图干扰峰、除色素能力和回收率(可达99%以上)等方面均获得理想结果。

综上，本试验采用乙腈溶剂提取和ENVI-Carb/LC-NH2柱联用净化。

3.2 样品定量中假阳性的判断及基质效应的排除

试验中发现样品种类不同、加标水平不同，基质增强效应也不同，同时发现仿刺参和菲律宾蛤仔样品均有本底，对扑草净检测的干扰不可忽视，样品中待测含量越低干扰越严重，故当样品中分析物含量接近(或超过)限量水平即处于边缘值时，极易造成结果的高估。为了保证定量的准确性，在测定过程中要尽量选择干净的样品作为空白基质，样品含量测试结果要保证同时用同批同类样品结合同一基质加标样品并与溶剂标准比较进行校正。

针对检测过程中复杂样品基质和扑草净目标物峰重叠产生背景干扰造成谱库检索匹配相似度降低及定量干忧的情况，Wu 等[16]采用化学计量法对扑草净进行解析，从韭菜样品的重叠峰中提取目标物信号，Yu 等[17]则采用免疫算法对头发中扑草净复杂重叠色谱信号进行解析，并均采用标准加入法进行定量。本试验对样品中的扑草净组分主要通过保留时间和定量离子等参数信息对采集到的谱图进行筛选判断是否有扑草净检出，以限量值10 μg/kg的30%，即7 μg/kg作为截止值，如果检出目标物，则认为该样品可能是非阴性的。考虑到样品中扑草净的峰值可能隐藏在漂移基线和高水平背景重叠峰里，本试验主要通过SIM方法确认，即同时监测潜在的非负性样品中241和184 2个特征离子，如果在样品和标准中的离子丰度比例偏差<20%则证实存在扑草净，即判断样品为非阴性，对检测含量可能超过10 μg/kg的阳性样品，则通过标准加入法进行精确的量化。

扑草净的检测受干扰因素较多。这可能是农业生产过程中先后使用了多种结构类似的三嗪类农药，加上土壤中原有残留的影响，从而导致样品中可能含有扑草净降解物及类似物，但还不能确定其在气质进样过程中是否共同对定量和谱图解析造成干扰，需进一步的试验论证。

4 结 论

本试验探索了水产品中扑草净的固相萃取—气质联用法检测法，采用乙腈提取Envi-Carb/LC-NH2串联固相萃取柱净化气质联用法检测结合标准加入法定量，采用同时监测2个特征离子进行确证有效排除了样品中的假阳性。试验结果表明，该方法灵敏度、准确度和精密度均满足国家规定的要求，可用于水产品中扑草净的检测和确证分析。