大鳞副泥鳅新品系的人工繁殖及胚胎发育

2020-11-19马本贺陶志英吴早保王海华徐先栋陈翠云

水产科学 2020年6期

马本贺，陶志英，吴早保，吴斌，王海华，徐先栋，陈翠云

( 1.江西省水产科学研究所，江西南昌 330039; 2.鹰潭市渔业渔政局，江西鹰潭 335000; 3.余江县宏鑫特种水产养殖有限公司，江西鹰潭 335200 )

我国泥鳅养殖品种主要有大鳞副泥鳅(Paramisgurnusdabryanus)和泥鳅(Misgurnusanguillicaudatus)2种，前者生长速度较快、抗病力强，后者口感较好且怀卵量多[1]。2012年以来，台湾泥鳅(P.dabryanusssp. Taiwan)引入我国大陆地区养殖，迅速获得大面积推广。研究表明，就品种分类而言，台湾泥鳅为大鳞副泥鳅的一个地方性种群[2]，未达到种的分化。体色是鱼类重要的表型特征，也是评价其商品价值和市场价格的重要指标，鱼类的体色主要由遗传、生理、环境等因素决定[3-4]。2014年，本研究团队在大鳞副泥鳅养殖群体中发现极少量体表呈金红色的变异个体，将其选出后以红体色为目标性状，通过定向交配和人工选育，目前已获得红色性状稳定遗传的群体，暂命名为“赣红1号”品系(以下简称“赣红1号”)(图1)，其肉质鲜嫩、营养丰富，体色金红、泳姿绰约，兼具食用和观赏价值，深受消费者青睐。

鱼类的早期发育研究是水产养殖种苗繁育的基础之一，我国学者对鳅科鱼类的早期发育已有研究。如邱楚雯等[5]观察了台湾泥鳅的早期发育过程；杜启艳等[6]对豫北地区大鳞副泥鳅的胚胎发育进行了观察；刘自然等[7]探究了温度对泥鳅胚胎卵裂间隔时间的影响。目前，针对体色变异的泥鳅发育生物学研究尚未见报道，笔者通过收集性成熟的“赣红1号”个体进行人工繁殖试验，观察并分析其胚胎发育过程，旨在探究大鳞副泥鳅新品系的胚胎发育规律，为提高其人工繁殖的受精率和孵化率提供关键参数和理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验亲鱼：亲本雌鳅来自余江县宏鑫特种水产养殖有限公司，腹部膨大柔软有弹性，平均体长(17.23±1.45) cm，体质量(56.92±3.23) g；雄鳅来自江西省水产科学研究所，体型匀称，背部后方两侧脊条明显，平均体长(18.50±1.51) cm，体质量(42.30±2.86) g，试验在江西省水产科学研究所泥鳅黄鳝科研试验基地进行。

催产药物：绒毛膜促性腺激素(HCG)和促黄体素释放激素A2(LHRH-A2)为宁波第二激素厂生产，地欧酮(DOM)为宁波三生生物科技有限公司生产。

图1 “赣红1号”亲本Fig.1 The brookstocks of loach “Ganhong No.1”

试验物品及器材：黄泥块，80目过滤网，塑料盆，鹅毛，生理盐水，孵化桶，孵化网箱，气泵，光学生物显微镜。

1.2 试验方法

1.2.1 人工繁殖

人工催产：催产药物浓度及含量为绒毛膜促性腺激素500 IU/mL、促黄体素释放激素A28.33 mg/mL、地欧酮3.33 mg/mL，注射量为雌鳅0.2 mL/尾、雄鳅0.1 mL/尾。泥鳅经麻醉后用润湿的毛巾擦干体表水分和黏液，左手穿戴干净棉质手套固定住泥鳅。采取背部肌肉注射药物的方法，右手执注射器，从背鳍基部两侧肌肉较多处向下与鱼体呈30°～45°的方向刺入0.3～0.5 cm，迅速注入药液。

人工授精及孵化：使用压腹挤卵、压腹挤精的方式进行半干法授精，受精完成后，采取孵化桶和网箱两种孵化方式。孵化桶孵化前先将受精卵人工脱黏，孵化桶保持循环流水，微孔气石增氧。网箱孵化时受精卵未经脱黏，清洗后直接用鹅毛刷蘸取均匀泼洒到悬浮于孵化池的网箱中，受精卵利用自身黏性粘附在网箱底部的网片上，进行静水增氧孵化。

1.2.2 取样和观察

取样时用玻璃培养皿在孵化桶中捞取适量受精卵，取样频率为卵裂至囊胚阶段10 min/次，原肠至出膜阶段30 min/次，每次随机取样受精卵不少于30粒，观察并记录胚胎各时期的发育时间和形态特征，以50%以上的个体发育到某阶段作为该阶段的起始时间。观察、拍摄均在光学生物显微镜下进行，使用ToupCam显微数字相机(杭州图谱光电科技有限公司)和Algae C浮游生物计数分析智能鉴定系统(杭州万深检测科技有限公司)进行图片的拍照及处理。

2 结果

2.1 人工繁殖

2018年5月24日—6月4日进行3个批次人工繁殖试验，共催产雌鳅80尾、雄鳅19尾，在(26.0±1.0) ℃水温下平均效应时间14.7 h，催产率(93.43±2.20)%，受精率(76.67±2.89)%，孵化率(72.33±5.51)%，获得水花苗28.9万尾(表1)。

2.2 胚胎发育

“赣红1号”的成熟卵子为金黄色圆形，属于端黄卵中的富质卵，细胞质分布均匀，极性不明显，平均质量为343.6 μg/粒。受精卵为具有黏性的沉性卵，平均膜径1052.49 μm。在受精卵和质膜之间有一层均匀的卵周间隙，平均厚度为72.32 μm(图2a)。按照一般硬骨鱼的胚胎阶段划分方法[8-9]，受精卵在水温(26.9±0.8) ℃、溶解氧≥8.25 mg/L、pH 8.2环境下，经历7个阶段29个时期，历时26.42 h孵化出膜，完成胚胎发育成为前期仔鱼。胚胎发育过程及各个阶段主要形态特征见表2。

2.2.1 胚盘形成

受精后卵周间隙逐渐扩大，约0.57 h后原生质集中于动物极形成隆起状半透明的胚盘(图2b)。

2.2.2 卵裂

“赣红1号”的卵裂方式为不完全卵裂中的盘状卵裂。受精后0.93 h，动物极出现1道卵裂沟，将胚盘从中间分开，经裂形成2个大小相等的分裂球，进入2细胞期(图2c)。受精后1.23 h，形成第2个卵裂沟，第2次分裂形成“2×2”排列的4个形状相似的分裂球，进入4细胞期(图2d)。受精后1.62 h，胚盘同时形成2个平行的卵裂沟，进行第3次分裂，形成“2×4”排列的8个分裂球，进入8细胞期(图2e)。受精后1.92 h，同时形成2个卵裂沟进行

表1 “赣红1号”繁殖统计Tab.1 Spawning statistics of “Ganhong No.1”

图2 “赣红1号”的胚胎发育Fig.2 Embryonic development of “Ganhong No.1”a.受精卵; b.胚盘形成; c.2细胞期; d.4细胞期; e.8细胞期; f.16细胞期; g.32细胞期; h.多细胞期; i.桑葚期; j.高囊胚期; k.低囊胚期; l.原肠早期; m.原肠中期; n.原肠晚期; o.神经胚期; p.胚孔封闭期; q.肌节期; r.眼基出现期; s.眼囊期; t.尾芽期; u.耳囊期; v.晶体出现期; w.耳石出现期; x.肌肉效应期; y.心跳期; z.尾颤期; a1.出膜前期; b1.出膜期; c1.初孵仔鱼.a.fertilized egg; b.blastodisc formation; c.2-cell stage; d.4-cell stage; e.8-cell stage; f.16-cell stage; g.32-cell stage; h.multi-cell stage; i.morula; j.high blastula; k.low blastula; l.early gastrula; m.middle gastrula; n.late gastrula; o.neurula；p.closure of blastopore; q.myomere stage; r.eye primordia; s.optic sac; t.tail bud stage; u.auditory vesicle; v.crystal stage; w.appearance of otolith; x.musclar contraction stage; y.heart beating stage; z.tail fibrillation stage; a1.pre-hatching stage; b1.hatching stage; c1.newly hatched larva.

表2 “赣红1号”的胚胎发育Tab.2 Embryonic development of “Ganhong No.1”

第4次分裂，形成“4×4”排列的16个分裂球，进入16细胞期(图2f)。受精后2.28 h，胚盘进行第5次卵裂，形成32个分裂球，分裂球开始不规则排列，进入32细胞期(图2g)。随着胚盘继续卵裂，2.72 h，形成大小不一、界限相对明显的多个分裂球，进入多细胞期(图2h)。分裂球持续分裂，细胞界限开始模糊、数量较多难以计数，呈现多层重叠排列，受精后3.20 h，在胚盘处形成桑葚状的细胞团，进入桑葚期(图2i)。

2.2.3 囊胚

动物极细胞继续分裂，分裂球数量、层数进一步增多，受精后3.88 h，众多分裂球组成的囊胚宛若一顶隆起的帽子覆盖在胚盘上，进入高囊胚期(图2j)。高囊胚后，动物极细胞向植物极移动，囊胚高度降低，受精后4.38 h，进入低囊胚期(图2k)。

2.2.4 原肠

囊胚层细胞向植物极移动，胚盘下包，受精后5.43 h，胚环出现，进入原肠早期(图2l)。胚盘继续下包，受精后6.43 h，胚层细胞包裹卵黄的1/2，胚环一端隆起形成胚盾，进入原肠中期(图2m)。受精后8.07 h，胚盘下包至卵黄3/4～4/5处，胚盾增长，胚体雏形出现，进入原肠晚期(图2n)。

2.2.5 神经胚

受精后9.72 h，胚环前端膨大形成头部，胚体逐渐形成，进入神经胚期(图2o)，此时期出现胚孔，胚体背部形成神经板。受精后10.07 h，进入胚孔封闭期(图2p)，胚孔闭合，胚层包住卵黄，神经板开始内凹，尾芽原基出现。

2.2.6 器官形成

胚体继续发育，受精后10.47 h，胚体中部出现3～5对肌节，进入肌节期(图2q)。出现肌节约0.58 h后，头部两侧出现1对突起的眼基，为眼基出现期(图2r)；0.92 h后，眼基发育成椭圆形的眼囊，进入眼囊期(图2s)，此时肌节10～12对。受精后13.55 h，胚体后端腹面出现尾芽，称为尾芽期(图2t)，眼囊中间内陷形成视杯，肌节增加到16对。受精后15.57 h，胚体头部后端出现1对耳囊，称为耳囊期(图2u)，尾部开始与卵黄分离。受精后16.85 h，在视杯口出现近圆形的晶状体，称为晶体出现期(图2v)。受精后19.58 h，耳囊中出现2颗形状相似、大小相等的钙化耳石，进入耳石期(图2w)，此时尾鳍出现褶皱，胚体前端与卵黄囊连接处形成心脏原基。受精后20.85 h，胚体出现轻微的抽动，进入肌肉效应期(图2x)，胚体后半部分逐渐与卵黄分离，心脏原基发育成管状心脏，周围出现浅红色流动血液。受精后22.02 h，管状心脏开始有规律的搏动，进入心跳期(图2y)，平均搏动频率54次/min。心跳期持续1.67 h左右，胚体尾部开始不断无规则颤动，进入尾颤期(图2z)。

2.2.7 出膜

受精后24.80 h，胚体在卵膜内频繁转动，伴随着尾部的剧烈摆动，进入出膜前期(图2a1)。出膜前期持续约1.25 h，卵膜在尾部的作用下破裂，胚体尾部首先破膜露出，进入出膜期(图2b1)，胚体头部和卵黄仍在卵膜内，卵黄囊前端呈圆球状，后端为细长棒状。受精后26.42 h，尾部频繁摆动使胚体头部摆脱卵膜，整个胚体脱膜而出，成为初孵仔鱼(图2c1)。

初孵仔鱼呈黄色半透明状，肌节40节以上且器官清晰可见，平均全长3193.42 μm，肛前长2630.53 μm，体高688.69 μm。卵黄囊紧贴鱼体，前端由圆球形拉伸成长椭圆形，平均长径844.48 μm，短径563.20 μm，后端呈细长棒状，平均最宽210.88 μm，长1352.14 μm。心搏率72～85次/min，周围淡红色血液涌动明显。肠管末端与身体近似垂直，消化道未贯通，多沉在水底，偶作不规则短距离冲游。

3 讨论

3.1 泥鳅人工繁殖方法比较

泥鳅1～2龄即可达到性成熟，生殖期4—10月均可产卵，养殖生产上以5—6月和9—10月为繁殖旺季，称之为春繁和秋繁。泥鳅的催产药物主要是绒毛膜促性腺激素和地欧酮，搭配促黄体素释放激素A2或鲑鱼促性腺激素类似物，用NaCl溶液将药物稀释到一定含量混匀后采取背部注射方式进行催产。根据亲鳅规格和发育情况，亲鳅雌雄比、催产药物的剂量可酌情增减[5,10-14](表3)，一般注射剂量为雌鳅0.2 mL，雄鳅减半。催产后效应时间随环境温度和性腺发育的不同而有所改变，依据泥鳅的生物学特性，效应环境温度基本保持在20～26 ℃，效应时间11～18 h。受精方式以人工授精为主，雌鳅采取压腹挤卵的方法，取精方法分为压腹挤精和剖杀取精2种，剖杀取精的受精率在50%～83%，压腹挤精受精率69.2%～86%。在雄鳅体质健康、性腺发育良好的情况下，采用压腹挤精，可以在不降低受精率的前提下降低雄鳅死亡率。采用人工授精方式的台湾泥鳅催产率可达90%以上，而自然交配方式的催产率仅有52%，根据生产观察推测其主要原因是台湾泥鳅体型较为粗壮，雌鳅和雄鳅很难完成相互缠绕的交配和受精过程，导致催产率降低，造成了亲鱼的浪费，而人工授精借用人力排出成熟的卵子和精子并使之混合受精，大大提高了催产率。2种孵化方式相比较，孵化桶孵化虽然操作相对复杂，优点是受精卵孵化率明显提高，适合大规模生产。“赣红1号”是大鳞副泥鳅的体色变异群体，两者的人工繁殖方法相似，本试验在团队前期工作的基础上，结合生产实际，采用亲鳅雌雄比5∶1、压腹挤精、孵化桶孵化的方式时，既能保持较高的受精和孵化率，又能减少雄鳅损耗，降低生产成本，提高生产效率。

3.2 “赣红1号”及鳅科鱼类胚胎发育特征

“赣红1号”的胚胎发育经历胚盘形成、卵裂、囊胚、原肠胚、神经胚、器官形成和出膜7个阶段，与正常大鳞副泥鳅发育时序相同。“赣红1号”的成熟卵子整体呈金黄色，大鳞副泥鳅的成熟卵子大多为橙黄色或浅黄色[15]。胚胎发育至心跳期“赣红1号”的心跳搏动频率达到54次/min，高于台湾泥鳅的15次/min[5]。“赣红1号”仔鱼出膜时全身无黑色素，整个仔鱼期体表呈半透明或金黄色，无明显的黑色素出现。大鳞副泥鳅仔鱼出膜时躯体或头部出现少量黑色素[16]，出膜后体表黑色素快速增多，至出膜后约12.5 h时，眼睛密布黑色素，肌体上下各出现一行黑色素[17]。随着发育的进行，大鳞副泥鳅仔鱼鳍、头、躯体等部位出现大量黑色素，“赣红1号”并无此现象。二者的差异表明“赣红1号”体色是先天形成的，从胚胎出膜期即表现出与正常大鳞副泥鳅的不同。

表3 “赣红1号”和台湾泥鳅的人工繁殖方式Tab.3 The methods of artificial propagation in “Ganhong No.1” and loach P. dabryanus ssp. in Taiwan, China

按照传统分类方法将鳅科分为花鳅亚科、条鳅亚科和沙鳅亚科3个亚科[18]，各亚科鳅类的胚胎发育划分阶段基本一致，但是其受精卵类型、发育时间和初孵仔鱼形态特征有较大差异。由表4可见，“赣红1号”和台湾泥鳅[5]、大鳞副泥鳅[16]、泥鳅[19]同属花鳅亚科，受精卵均为沉性卵，具黏性或微黏性，卵径为900～1210 μm；条鳅亚科的西昌高原鳅(Triplophysaxichangensis)[20]、东方高原鳅(T.orientalis)[21]、秀丽高原鳅(T.venusta)[22]和贝氏高原鳅(T.bleekeri)[23]亦为沉性卵，具有黏性或强黏性，卵径为1040～1480 μm；沙鳅亚科的中华沙鳅(Botiasuperciliaris)[24]、长薄鳅(Leptobotiaelongate)[25]和宽体沙鳅(B.reevesae)[26]受精卵则为无黏性的漂浮卵，卵径为1750～4790 μm。综合来看，沙鳅亚科的受精卵和出孵仔鱼均为最大，条鳅亚科次之，花鳅亚科最小。受精卵的大小和初孵仔鱼的全长呈正相关关系[27]，“赣红1号”的受精卵和初孵仔鱼分别为1052 μm和3193 μm，介于台湾泥鳅和大鳞副泥鳅之间，而与沙鳅亚科中长薄鳅受精卵和初孵仔鱼的长度4100 μm和 5200 μm相差甚远。

花鳅亚科和沙鳅亚科的胚胎平均孵化温度高于条鳅亚科，而花鳅亚科和沙鳅亚科的胚胎发育时间为26～38 h，远远低于条鳅亚科的78～358 h。孵化历时越长，初孵仔鱼的器官分化程度越高，“赣红1号”胚胎经26.42 h发育后初孵仔鱼则通体透明无黑色素，出膜时器官发育程度较低，而贝氏高原鳅胚胎经约287 h的发育，仔鱼出膜时器官发育程度较高，其口凹和肛门原基、鳃弓、胸鳍等器官原基已经形成，眼及身体出现大量黑色素，具备初步的视觉、运动能力。可能是因为各亚科鳅类的系统发育关系和长期演化过程中的适应性不同[28-29]，或者与温度[30]、溶解氧[31]等的外部环境有关。

本试验结果表明，“赣红1号”采用亲鳅雌雄比5∶1、压腹挤精、孵化桶孵化的方式可以达到良好的人工繁殖效果。其体色与自身遗传有关，与正常大鳞副泥鳅比较两者卵子类型、胚胎发育时序均相似。