虎皮鱼PtScd1基因序列、功能与表达分析

刘丽丽，张 蓉，王晓雯，朱 华

( 北京市水产科学研究所，渔业生物技术北京市重点实验室，北京 100068 )

硬脂酰辅酶A去饱和酶(SCD)是一种酰基辅酶A，是单不饱和脂肪酸合成途径的限速酶[1]，通过调控脂肪酸代谢过程改变细胞膜流动性[2]，在细胞膜应对低温胁迫的过程中发挥重要作用[3]。硬脂酰辅酶A去饱和酶广泛存在于单细胞生物[4]、哺乳动物[5]和人类[6]体内，在许多水生动物中也报道了硬脂酰辅酶A去饱和酶的活力和基因表达，包括鲤鱼(Cyprinuscarpio)[7]、斑马鱼(Daniorerio)[8]、莫桑比克罗非鱼(Oreochromismossambicus)[1,9]、草鱼(Ctenopharyngodonidella)[10]、团头鲂(Megalobramaamblycephala)[11]、大菱鲆(Scophthalmusmaximus)[12]、黄颡鱼(Pelteobagrusfulvidraco)[13]、普通章鱼(Octopusvulgaris)[14]、大黄鱼(Pseudosciaenacrocea)[15]等。硬脂酰辅酶A去饱和酶在鱼类应对低温胁迫的过程中具有重要作用[3]。低温驯化过程中遮目鱼(Chanoschanos)肝细胞膜的脂肪酸组成与硬脂酰辅酶A去饱和酶变化显著，肝细胞微粒体硬脂酰辅酶A去饱和酶活性与单不饱和脂肪酸含量具有相关性[16]；通过改变饲料配方提高罗非鱼Scd1转录本含量和活性，脂肪酸不饱和指数(C16:1/C16:0；C18:1/C18:0)相应变化，能够提高罗非鱼低温耐受能力[17]。

虎皮鱼[Puntius(Puntigrus)tetrazona]是一种广受水族爱好者欢迎的小型热带观赏鱼，成鱼体长5～7 cm。体表浅黄或棕黄色，上覆4条垂直的浓黑色条纹，因体表斑斓似虎纹，故称为虎皮鱼，学名四带无须。虎皮鱼对温度变化十分敏感，属于狭温热带鱼类，适宜水温23～28 ℃[18]。温度降低则体色暗淡、婚姻色减退、摄食力减弱、游动迟缓，导致生病甚至死亡。由于这一生物学特性，虎皮鱼的生产养殖严重受制于季节性气候变化和昼夜温差。在生产养殖过程中，渔场通常依赖地热或煤炭燃烧保持适宜水温；在终端消费市场，观赏鱼爱好者通常使用加热棒保持水温恒定，需要较大的能源消耗，提高虎皮鱼低温耐受能力具有重要的实践意义[3]。

笔者通过RACE技术克隆虎皮鱼Scd1(PtScd1)基因cDNA序列，分析序列同源性，预测其开放阅读框(ORF)和氨基酸序列结构，构建蛋白质三维结构模型；检测PtScd1基因在虎皮鱼不同组织中的特异性表达，分析梯度低温胁迫下PtScd1基因表达水平的变化，明确PtScd1基因在成年虎皮鱼体内存在组织特异性和温度诱导型表达特征，研究结果将为提高虎皮鱼低温存活率提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 虎皮鱼养殖

虎皮鱼在本实验室完成驯化后长期养殖，养殖条件为：水温25～27 ℃，pH 6.5～7.4，硬度6～7，养殖系统具备独立循环过滤和连续曝气装置，每日定时定量投喂商品干饲料2次，投喂10 min后吸除饲料残渣。

1.1.2 梯度低温胁迫试验

挑选体型规格相近、健康活泼的8月龄虎皮鱼150尾(不分雌雄)，用于梯度低温胁迫试验。将150尾虎皮鱼随机分为5个养殖缸，每个养殖缸30 L，含有30尾虎皮鱼。试验第1 d水温保持27 ℃，次日起每24 h降低温度如下：△T1=4 ℃/d，△T2=4 ℃/d，△T3=4 ℃/d，△T4=2 ℃/d，其他条件维持不变。各温度梯度维持24 h后，每缸随机取3尾虎皮鱼(图1)，间氨基苯甲酸乙酯甲磺酸盐(Sigma-Aldrich，E10521，商品名MS-222)溶液麻醉后，解剖脑、鳃、肝脏和肌肉组织，液氮速冻，超低温冰箱(Thermo，Forma 88000)-80 ℃保存。试验共3个平行。

图1 虎皮鱼梯度低温胁迫与取样流程Fig.1 The gradient cooling stress and sampling procedure in tiger skin barb P. tetrazona

1.2 方法

1.2.1 总RNA提取

虎皮鱼脑、鳃、肝脏和肌肉组织自超低温冰箱取出后，立即加入组织总RNA提取试剂RNAiso Plus(TaKaRa，D9108A)，组织匀浆仪(MP，FastPrep-24)进行组织破碎和匀浆，提取总RNA，操作按照试剂说明书进行。Nanodrop2000核酸蛋白浓度检测仪测定总RNA浓度和污染情况，琼脂糖凝胶电泳检测总RNA完整性，超低温冰箱-86 ℃保存备用。

1.2.2 cDNA第一链合成与保守序列克隆

分别以脑、鳃、肝脏和肌肉总RNA为模板，采用1st strand cDNA合成试剂盒(TaKaRa，6110A)合成cDNA第一链。Nanodrop2000核酸蛋白浓度检测仪测定cDNA产物浓度和纯度，超低温冰箱-86 ℃保存备用。根据GenBank中公布的鱼类Scd1基因cDNA保守序列，利用CODEHOP软件设计简并引物SCD-MAFQ-F、SCD-MWGN-R，SCD-VMFQ-F、SCD-NYHH-R(表1)。按照Ex Taq酶(TaKaRa，DRR001A)说明书配制PCR反应体系，按照如下程序进行PCR扩增反应：98 ℃预变性3 min；98 ℃变性10 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，36个循环；72 ℃继续延伸10 min。PCR产物进行1%琼脂糖凝胶电泳验证，送交擎科新业生物技术公司进行测序。

1.2.3 RACE克隆

根据简并引物PCR扩增获得PtScd1 cDNA部分保守序列，Primer3Web(http://primer3.ut.ee/)在线设计引物SCDGSP1和SCDNGSP1用于5′RACE扩增，设计引物SCDGSP2和SCDNGSP2用于3′RACE扩增。采用SMARTer RACE 5′/3′ Kit(Clontech，634858)试剂盒，按照说明书配制反应体系，以肝脏组织cDNA为模板，进行PCR扩增，分别得到PtScd1 cDNA的5′和3′ RACE产物。PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳分离鉴定，凝胶DNA回收试剂盒(TaKaRa，9762)回收目的条带DNA，送交擎科新业生物技术公司进行测序，采用SeqMan软件对测序片段与得到的虎皮鱼Scd1 cDNA部分保守序列进行拼接。以肝脏组织总RNA为模板，ScdCDS-F和ScdCDS-R为引物，进行PCR验证。

1.2.4 cDNA序列结构分析与氨基酸序列预测

拼接序列经BLAST在线(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/)比对，结果表明该序列与美国国立生物技术信息中心数据库公布的Scd1 cDNA序列具有高度同源性；使用ClustalX2和DNAMAN软件

表1 研究所用引物信息Tab.1 Information list of the primer used in the experiment

进行序列同源性比对和系统发育进化树构建，美国国立生物技术信息中心ORFfinder在线(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/)预测开放阅读框(ORF)和可能编码的氨基酸序列。通过BankIt(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/WebSub/)将PtScd1 cDNA序列上传到GenBank数据库。CDD数据库在线(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi)预测氨基酸序列的保守结构域。Swiss-Model在线(https://swissmodel.expasy.org/)，ProMod3 Version 2.0.0进行同源建模，预测其三级结构。

1.2.5 实时荧光定量qPCR

根据获得的PtScd1 cDNA序列，Primer3Web(http://primer3.ut.ee/)在线设计引物SCD-qF和SCD-qR用于实时荧光定量PCR(qPCR)(表1)。以本研究中获得的脑、鳃、肝脏和肌肉组织cDNA为模板，虎皮鱼gapdh基因为内参基因(表1)，按照荧光定量PCR试剂盒(天根，FP209)说明书配制20 μL反应体系，在ABI StepOne Plus荧光定量PCR仪器进行qPCR反应，反应程序为：98 ℃预变性3 min；95 ℃变性5 s，60 ℃退火并延伸(采集信号)30 s，40个循环。溶解曲线信号采集程序为：95～60 ℃，2.5 ℃/s。

1.2.6 数据分析与绘图

OriginPro 8.0软件对数据进行统计学分析和绘图，单因素方差分析检验显著性水平，Levene检验进行方差同质性分析，LSD和S-N-K方法进行事后多重检验。所有数值表示为平均值±标准差。

2 结 果

低温胁迫过程中，虎皮鱼逐渐死亡；当温度降至13 ℃时，累积死亡率约达50%。试验过程中，以停止呼吸为死亡指标，随时移除死亡虎皮鱼。

2.1 虎皮鱼Scd1(PtScd1)基因cDNA序列结构与保守性分析

通过RACE克隆和序列拼接获得一段1338 bp的虎皮鱼Scd1基因cDNA序列，将其命名为PtScd1，序列在GenBank数据库上传(登录号：MN364671)。Blastn序列比对发现，PtScd1 mRNA序列与鲤鱼(U31864.2)、团头鲂(KF918746.1)、草鱼(KF918746.1)、大菱鲆(KC189928.1)、矛尾复虾虎鱼(Acanthogobiushasta，KT384417.1)和斑马鱼(NM_198815.2)Scd1 cDNA的序列相似度分别为88.58%、83.84%、83.84%、82.05%、79.98%和79.03%。

ORFfinder预测PtScd1 开放阅读框位于cDNA序列94～1074位，包含981个核苷酸，编码326个氨基酸。将PtScd1开放阅读框序列与鲤鱼、团头鲂和斑马鱼Scd1 mRNA序列进行多序列比对，发现其序列相似度分别为88.52%、83.49%和79.36%，表明PtScd1基因编码序列与鱼类相比具有高度保守性(图2)。

2.2 PtSCD1蛋白质结构与功能预测

预测PtScd1基因开放阅读框编码326个氨基酸，该氨基酸序列命名为PtSCD1，蛋白质分子量37.62 ku。PtSCD1氨基酸序列33～311位比对到脂肪酸去饱和酶保守结构域(序列号：pfam00487)，长度为248个氨基酸，二进制值为63.12，期望值为1.96×10-11(图3)。

Swiss-Model同源建模发现，PtSCD1蛋白与4ymk.1.A(PDB，2019-08-02)序列同源性高达63.34%，属于单体蛋白，序列相似性为0.5，比对范围氨基酸序列第6～326位，覆盖度95%，序列比对表明，其蛋白功能为酰基辅酶A去饱和酶1。根据其三维结构(图4)，预测PtSCD1蛋白有2个高度保守的锌离子结合位点，有2个配体结合位点，分别和硬脂酰辅酶A(ST9)、(Z)-十八碳-9-羟基-(2R)-2,3-二氧氮自由基丙酸(MPG)结合，但是这2个配体的结合位点序列保守性很差。

图2 PtScd1基因开放阅读框序列比对结果Fig.2 The BLAST results of PtScd1 gene open reading frame sequence 表示序列相似度75%， 表示序列相似度50%，…表示序列缺失. indicates 75% sequence similarity, indicates 50% sequence similarity, … indicates sequence loss.

图3 蛋白质保守结构域预测结果Fig.3 The prediction of the protein conserved domain

图4 PtSCD1蛋白三维结构模式Fig.4 The three dimensional structure model of PtSCD1 protein

2.3 PtScd1转录本组织特异性与温度诱导表达

qPCR分析发现，PtScd1在不同组织(27 ℃)中的表达水平依次为肝脏>脑>肌肉>鳃(图5)。在梯度低温胁迫(23、19、15、13 ℃)下，基因表达水平上调。在脑组织中PtScd1转录本丰度与温度相关性分析发现泊松系数为-0.97(P<0.01)，表明脑组织中PtScd1转录本丰度与温度具有负相关性，随着温度降低，PtScd1转录本依赖性上调表达。低温胁迫下鳃和肌肉组织PtScd1转录本丰度均显著高于相应对照组，肝脏组织13 ℃处理组PtScd1转录本丰度也显著高于其对照组(P<0.01)。

图5 PtScd1转录本相对表达水平定量分析Fig.5 The comparative quantitative analysis of PtScd1 transcripts abundancea.虎皮鱼脑、鳃、肝脏和肌肉组织PtScd1表达水平定量分析(log10)，其中以脑组织为对照组，所有样品处理温度均为27 ℃，上标不同字母表示差异显著(P<0.05)；b.低温胁迫下虎皮鱼各组织PtScd1表达水平定量分析，每个组织中以27 ℃处理组作为对照组；c.脑组织PtScd1转录本丰度与温度相关性分析的散布矩阵图，r2=-0.97，P<0.01；图中所有数值表示为平均值±标准差；*表示与同一组织样品对照组(27 ℃)有显著差异(P<0.01).a.the comparative quantitative analysis of PtScd1 transcripts abundance in brain, gill, liver and muscle tissues of P. tetrazona with brain tissue as control group, and all tissue samples are treated at 27 ℃, and means with different letters are significant difference (P<0.05); b.the quantitative analysis of PtScd1 transcripts abundance under gradient cold stress with 27 ℃ treatment as control group; c. the scatter matrix of correlation between temperature and PtScd1 transcripts abundance. r2=-0.97, P<0.01; all the values are expressed as mean±SD. * indicates significance difference compared to control group (27 ℃), P<0.01.

3 讨 论

细胞膜结构的修饰是变温动物对温度变化的普遍应答方式，这一机制称为恒黏适应性机制[19]。鱼类细胞膜对低温胁迫的恒黏适应性主要是通过改变膜脂的组成和结构实现的，不饱和脂肪酸链的改变会导致磷脂双分子层曲率和流动性的变化，从而改变细胞膜的构象和功能性[20-21]。不饱和脂肪酸在细胞质中合成后，经过第一步去饱和作用，随后经过延伸、去饱和，定向分流用于甘油三磷脂、胆固醇酯和磷脂合成。硬脂酰辅酶A去饱和酶参与第一步的去饱和作用，在脂肪酸链的2个碳原子之间形成双键，生成单不饱和脂肪酸，是不饱和脂肪酸合成途径的限速步骤。

3.1 虎皮鱼PtScd1 cDNA序列

本研究以虎皮鱼肝脏组织总RNA为模板，克隆到一段Scd1 cDNA序列，序列全长1338 bp，其中开放阅读框长度981 bp，经数据库比对发现，与Scd1序列具有较高相似度，确定其为虎皮鱼Scd1基因序列，因此命名为PtScd1。

目前已知Scd基因存在多种亚型。人类体内有2个亚型Scd1和Scd5[22]，小鼠体内有4个亚型Scd1、Scd2、Scd3和Scd4。在水生动物中，鲤鱼已知有2种Scd基因亚型[23]，而其他鱼类仅含有1种Scd基因(Scd1)[5]。Scd不同亚型对底物的偏好型不同，能够与不同碳链长度的脂肪酸结合，在特定位置形成双键，其中Scd1负责在硬脂酰(18:0)辅酶A中delta-9(C9—C10)位置之间形成双键，合成单不饱和脂肪酸[24-25]。PtScd1 cDNA序列与鲤鱼、团头鲂Scd1序列具有较高相似度(>80%)，预测其蛋白质功能具有保守性，表明PtScd1可能参与虎皮鱼单不饱和脂肪酸合成通路[24-25]。

3.2 虎皮鱼PtSCD1蛋白结构与功能预测

PtSCD1蛋白含有326个氨基酸，其中第33～311位氨基酸为脂肪酸去饱和酶保守结构域，形成口袋状的配体结合结构域，与硬脂酰辅酶A结合，催化后者形成双键(delta-9)。脂肪酸双键影响含脂质的性质和功能。如磷脂中脂肪酸双键的数量和位置决定了细胞膜的理化性质[26]：含有不饱和脂肪酸的磷脂具有更低的相变温度，促进细胞膜转变为无序液相状态[27-28]，细胞膜相变对维持细胞正常功能具有重要意义[29]。

引入双键的反应具有高度特异性，哺乳动物SCD1蛋白晶体结构解析了其底物偏好性和引入双键位置(delta-9)的决定机制。人类和小鼠SCD1蛋白呈锥形体，含有4个跨膜螺旋结构，形成一个狭窄的口袋结构与底物结合[30-31]。该底物结合口袋内部为疏水结构，在结合硬脂酰辅酶A酰基链的C9和C10位置形成锐利的尖角。底物结合位点表面带正电荷，特异性识别带有磷酸基团的辅酶A，并对其酰基链结构进行重组。因此推测，SCD1口袋结构特异性识别引入双键的位置(delta-9)。

三维结构模型预测PtSCD1蛋白有2个锌离子结合位点，这一结论是由Swiss-model蛋白质模型预测的原理决定的，模型预测过程中，根据氨基酸序列的相似性，极大地参考了已经公布的人和小鼠SCD1蛋白质晶体结构。虽然在人和小鼠SCD1晶体结构中检测到2个锌离子，但科学家认为这是蛋白质过表达所致[30-31]，并预测天然SCD1蛋白与铁离子而非锌离子结合。这是因为：(1)锌离子通常为四面体配位，而SCD1的离子结合位点为八面体，铁离子正是典型的八面体配位；(2)亚铁离子(0.92 Å)和锌离子(0.88 Å)的离子半径相近；(3)双铁离子结合位点在delta-9硬脂酰基载体蛋白(ACP)去饱和酶等氧化酶中有广泛研究[32]。SCD1蛋白与锌离子的错配结构导致纯化到的SCD1蛋白不具有生物活性。最近有研究将小鼠SCD1晶体结构中的锌离子去除，重新加入2个亚铁离子，发现SCD1蛋白结构没有发现明显的变化[33]。

基于此，笔者认为，虎皮鱼PtSCD1蛋白的保守组氨酸残基和精氨酸残基，在靠近底物结合口袋的尖角处，形成了双铁离子结合位点，而非锌离子结合位点。

3.3 低温胁迫下虎皮鱼PtScd1转录本表达特征

哺乳动物Scd1基因表达具有组织广泛性，在肝、肾、脾、心脏、脂肪组织、乳腺组织、皮肤、哈德腺等组织均有分布。在水生动物中，Scd1基因也在多个组织表达。斑马鱼[8]、遮目鱼[10,34]在身体各个组织均能检测到该基因表达，草鱼各个组织也检测到Scd1基因表达，但是在肝脏中表达量最高，而在脑中表达量很低[35]。鲤鱼[23]、罗非鱼[1]体内Scd1基因仅在肝组织表达。本研究发现，PtScd1转录本在虎皮鱼脑、鳃、肝脏和肌肉组织均有表达，且在肝脏中表达量最高，其次是脑和肌肉组织，在鳃中表达量最低。不同物种间的表达谱差异可能是物种特异性调控机制引起的[8]，反映了不同物种在适应环境过程中对PtScd1基因的不同依赖程度[34,36]。本底表达水平的组织差异性与各组织的生物学功能有关，肝脏是鱼类脂肪合成的主要场所，在鱼类脂代谢过程中起着重要的调节作用，PtScd1基因在肝脏组织的高表达可能与肝脏参与调控脂肪酸合成和代谢有关[37]。

大量研究发现，Scd1基因在鱼类应对低温胁迫的过程中具有关键作用：草鱼肝脏中Scd1转录本丰度在15 ℃处理21 d后开始上升[10]；尼罗罗非鱼冷诱导7 d后Scd1转录本丰度上升了16倍[38]；鲤鱼由30 ℃逐渐降至10 ℃后，Scd1转录本丰度上升了8～10倍[7]；大黄鱼最适生长温度为15 ℃，当温度降至7 ℃时，肝脏和大脑中Scd1转录本丰度显著上升[15]。本试验在脑、鳃、肝脏和肌肉组织中都检测到，随着温度降低Scd1转录本丰度显著上升的现象；特别值得注意的是，在一定范围内脑组织Scd1转录本相对丰度与温度呈负相关趋势，表明脑PtScd1具有作为响应低温胁迫分子标志物的潜能。其中，肝脏PtScd1转录本本底表达水平远高于其他组织，但是低温胁迫时的诱导程度低于其他组织，这可能是由于：一方面研究结果采用相对定量分析，考虑到肝脏PtScd1转录本高本底表达水平，低温胁迫下相对表达水平小幅度上升即意味着PtScd1转录本绝对含量大幅增加；另一方面 PtScd1转录本的组织特异性诱导表达可能与不同组织的特异性调控机制有关[34]。

低温下活性Scd1表达水平上升，不饱和脂肪酸比例增加，细胞膜保持一定的流动性，从而使鱼类低温耐受能力增强[3]。研究证实，提高罗非鱼Scd1转录本含量和活性，罗非鱼低温耐受能力相应提高[17]。另一方面，微粒体中Scd1的降解速率非常快，半衰期仅数小时[39]，机体可在转录和转录后水平上进行严格调控[40]，从而快速、精准响应环境胁迫。因此，预测PtScd1基因可能在虎皮鱼应对胁迫过程中发挥重要作用。

4 结 论

综上所述，本试验通过RACE克隆和序列拼接获得虎皮鱼Scd1(PtScd1)cDNA序列，预测开放阅读框序列包含981个核苷酸，编码326个氨基酸；氨基酸序列含有高度保守的脂肪酸去饱和酶结构域，蛋白质三维结构存在双铁离子结合位点，可结合底物硬脂酰辅酶A和(Z)-十八碳-9-羟基-(2R)-2,3-二氧氮自由基丙酸，在脂肪酸delta-9位置引物双键，催化生成单不饱和脂肪酸。qPCR技术检测到PtScd1转录本在虎皮鱼脑、鳃、肝脏和肌肉组织中表达，其中肝脏表达水平最高；低温诱导虎皮鱼PtScd1转录本丰度上升，脑组织PtScd1转录本相对表达水平与温度具有显著负相关性。预测PtScd1基因可能作为在虎皮鱼应对低温胁迫过程中发挥重要作用，研究结果将为提高虎皮鱼低温存活率提供理论依据。