P75NTR、SOX2在成釉细胞瘤中的表达及意义

赵 炜，达林泰，尚 多

成釉细胞瘤(ameloblastoma,AM)是常见的牙源性肿瘤，具有局部侵袭性、复发性，少数发生恶变、转移[1-3]。目前AM分子生物学领域的研究主要集中于基因突变[4]、细胞增殖[5]、凋亡以及血管生成[6-7]、骨破坏机制[3]等方面，但确切机制仍未明确，了解AM的侵袭机制对探索新型治疗方法具有重要意义。

肿瘤干细胞(cancer stem cells，CSCs)具有自我更新能力，维持着肿瘤的发生、发展和转移[8]。AM中是否存在肿瘤干细胞，是否介导肿瘤的侵袭性目前尚不清楚。神经嵴干细胞的标志物P75神经营养因子低亲和力受体(P75 neurotrophie factor receptor，P75NTR)可出现在牙发育各期[9]，参与神经细胞增殖、分化、凋亡、迁移等过程[10]，多种肿瘤的转移、复发均与P75NTR相关[11-12]。神经营养因子及其受体介导的途径在决定许多神经外胚层来源的细胞的存活或凋亡时起关键作用，AM源自牙源性上皮，P75NTR表达于AM中[13-14]，但其是否与肿瘤的侵袭性相关尚不清楚。

肿瘤干细胞标志物SOX2(SRY related HMG box gene 2)可以协同胚胎干细胞的标记物OCT4保持胚胎干细胞及成体祖细胞的多能性，可协同P75NTR调控上皮-间充质相互作用[9]。在肝癌、食道癌、口腔癌、喉癌等多种肿瘤中，SOX2、P75NTR均被认为是干细胞标志物，对肿瘤细胞的干性维持和增殖起重要作用，且可促进上皮间充质转化[15]，其在AM中明显表达[16]，但其在AM中是否有干细胞特性及参与肿瘤侵袭性，目前不是很清楚。本研究选择各型AM病例28例，通过免疫组织化学检测AM中SOX2、P75NTR的表达特点，探索AM中是否存在肿瘤干细胞及其是否参与肿瘤的侵袭性。

1 材料与方法

1.1 一般资料

选择2015年1月到2019年12月之间在本院口腔科住院手术治疗的28例AM病例、5例含牙囊肿、5例牙源性角化囊肿，另以1例口腔鳞状细胞癌、1例脑神经胶质瘤病例(石蜡切片为病理科库存的神经外科手术标本)作抗体表达的阳性对照，检测P75NTR、SOX2表达情况。收集AM病例患者男19例，女9例，年龄范围在18～67岁，平均年龄41.2岁，上颌骨4例，下颌骨24例；实性型18例，单囊型10例。所有研究对象均符合内蒙古自治区制定的伦理学标准并得到研究对象的知情同意。

1.2 免疫组织化学染色

常规SP法免疫组化染色，滴加兔多克隆抗体P75NTR(艾博抗(上海)贸易有限公司1∶150 ab52987)、SOX2(艾博抗(上海)贸易有限公司1∶300 ab97959)室温下孵育60 min；PBS冲洗3次，滴加辣根过氧化物酶二抗，室温孵育10 min。PBS漂洗3次，5 min/次；DAB显色、苏木素复染，PBS冲洗，氨水返蓝，封片。

1.3 免疫组化结果判定方法

根据染色结果，SOX2在上皮细胞的细胞核表达呈现黄色为阳性，P75NTR在上皮细胞的细胞质表达呈黄色为阳性。每张切片选取5个200倍视野进行结果判定，取平均值，所有切片均由2位病理医师评估判定。记分标准：阳性表达细胞占上皮细胞总数的百分率<10%为阴性(-)，百分率在10%～25%之间为弱阳性(+)，百分率在25%～50%之间为阳性(++)，百分率>50%以上为强阳性(+++)。

1.4 统计学方法

应用SPSS 24.0统计软件对实验结果进行数据分析，用非参数秩和检验，α=0.05为检验标准，P<0.05差异有统计学意义。

2 结果

2.1 P75NTR的在各组织中的表达情况

不同标记物在各组织中的表达情况见表1。①在实性型AM中，可见P75NTR不同程度阳性表达，在滤泡型和丛状型的周围柱状细胞强表达，中央星网状细胞弱表达(图1b、2b)。基底细胞型中上皮细胞均可见强表达(图3b)。因实性型AM中各病理亚型的生物学行为无明显差异，且样本量较小，故本文将滤泡型、丛状型、基底细胞型等各亚型合并为实性型AM一并统计。②在单囊型AM中，P75NTR的表达方式不同，Ⅱ型与含牙囊肿、牙源性角化囊肿的表达类似，Ⅰ型、Ⅲ型与实性型的表达类似(图4b)。P75NTR在实性型AM和单囊型AM中表达强度差异具有统计学意义(P=0.035)。③在含牙囊肿(图5b)和牙源性角化囊肿(图6b)中，P75NTR在紧靠基底膜的上皮细胞强阳性表达，而远离基底膜的上皮细胞阴性表达，P75NTR在AM和含牙囊肿(P=0.041)及牙源性角化囊肿(P=0.03)中表达强度差异具有统计学意义。口腔鳞状细胞癌和脑胶质瘤作为阳性对照，均可见细胞膜、细胞质阳性表达(图7b、8b)。

表1 P75NTR、SOX2在各病种中的表达强度

2.2 SOX2的表达情况

28例AM中仅有9例上皮细胞阳性表达(图1a、2a、3a、4a)，5例含牙囊肿中有3例(图5a)、5例牙源性角化囊肿中有4例(图6a)上皮细胞不同程度阳性表达。SOX2在实性型AM和单囊型AM中(P=0.759)、AM与含牙囊肿中的表达差异无统计学意义(P=0.207)。AM与角化囊肿中的表达差异有统计学意义(P=0.045)。口腔鳞状细胞癌和脑胶质瘤作为阳性对照，均可见细胞核阳性表达(图7a、8a)。

a:SOX2表达阴性；b:P75NTR在周围柱状细胞强阳性表达，中央星网状细胞阳性表达

a:SOX2在部分肿瘤上皮细胞的细胞核中表达；b:P75NTR在外周柱状细胞的细胞膜、细胞质强阳性表达，中央星网状细胞表达较弱

a:SOX2阴性表达；b:P75NTR在整个上皮岛细胞质中强阳性表达

a:SOX2阴性表达；b:在紧邻基底膜柱状上皮细胞胞膜、胞浆P75NTR强阳性表达，远离基底膜上皮细胞阴性表达

a:SOX2在上皮细胞核强表达；b:P75NTR在紧邻基底膜的上皮细胞的细胞膜、细胞质强阳性表达，远离基底膜上皮细胞阴性表达

a:SOX2在上皮细胞核弱表达；b:P75NTR在紧邻基底膜的上皮细胞的细胞膜、细胞质强阳性表达，远离基底膜上皮细胞阴性表达

a:SOX2在细胞核强表达；b:P75NTR在细胞膜、细胞质强阳性表达

a:SOX2在细胞核强表达；b:P75NTR在细胞膜、细胞质强阳性表达

3 讨 论

成釉细胞瘤(AM)是一种具有侵袭性的牙源性肿瘤[17]，目前AM的确切侵袭机制尚未明确，了解AM的侵袭机制对探索新型治疗方法具有重要意义。本文通过免疫组织化学检测干细胞标记物P75NTR、SOX2在AM中的表达情况，探索AM中是否存在肿瘤干细胞及其与AM侵袭性的相关性。

肿瘤干细胞是实体恶性肿瘤中存在的特定细胞亚群，其对肿瘤不受控制的增殖起重要作用，对介导肿瘤侵袭、转移及疗效等方面起至关重要的作用[18]。因此治疗肿瘤的关键是要将这些对肿瘤持久增殖起重要作用的、特定的细胞亚群根除[19]，如何准确定位并分离鉴定出CSCs是根治恶性肿瘤急需解决的问题，然而目前CSCs缺乏特异性标志物[20-24]。

P75NTR出现在牙齿发育的各个时期[9]，可以作为细胞标记物来纯化颅神经嵴来源的外胚间充质干细胞[25]，通过上皮-间充质的相互作用，在成牙、矿化过程中发挥着重要作用[25]。P75NTR也参与神经细胞增殖、分化、凋亡、迁移等过程[10]，且P75NTR与多种肿瘤复发、转移、预后密切相关[11]。

Sathi对干细胞标记物CD133、CD44、ABCG2和细胞增殖活性标志物Ki-67在AM中的表达情况分析，发现各标志物在上皮岛周围柱状细胞中均有表达，表明阳性表达的外周柱状细胞对于维持细胞的增殖活性有重要作用[26]，推测AM中周围柱状细胞维持着整个上皮岛的更新，为主要参与肿瘤侵袭的细胞，其可分泌基质金属蛋白酶[27]，整合细胞外基质及降解基底膜[28]，便于上皮细胞的侵袭、迁移，增加肿瘤的破骨能力；与间质细胞直接接触，通过上皮-间充质相互作用，改变肿瘤微环境[29]，增强肿瘤的侵袭能力。P75NTR在实性型AM中外周柱状细胞表达强度明显高于中央星网状细胞，在单囊型AM中紧邻基底膜的柱状细胞膜、细胞质P75NTR强表达, 而远离基底膜上皮细胞阴性表达，进一步推测在AM中紧邻基底膜的P75NTR阳性表达细胞中极有可能存在肿瘤干细胞，与肿瘤的增殖相关。实性型和单囊型AM中P75NTR的表达有差异(P<0.05),而实性型的侵袭性强于单囊型AM[30-31]，结合P75NTR阳性细胞在实性型AM中的分布情况，推测P75NTR表达阳性的外周柱状细胞中的肿瘤干细胞可能与AM侵袭相关。同时P75NTR在AM和含牙囊肿(P=0.041)及牙源性角化囊肿(P=0.03)中表达强度差异具有统计学意义，进一步证实P75NTR表达阳性的外周柱状细胞，可能参与肿瘤的侵袭性。同时，P75NTR在外周柱状细胞强表达，其可能为AM的潜在表面标志物，为AM的靶向治疗提供新的思路。

SOX2是胚胎和成体干细胞的一种转录因子，它是诱导多能干细胞的关键转录因子之一，SOX2过度表达与食管癌[15]、肺癌[21]和乳腺癌[23]的发展密切相关，对于维持CSCs的干性有重要作用[32]，是一种干细胞和祖细胞标记物。其可以作为成釉细胞癌分级的一个标志[33]，SOX2在牙齿发育中对上皮细胞的干性维持有重要作用，在多囊型AM的各种亚型上皮岛中均有SOX2的表达，推测在AM中SOX2可能参与细胞干性的维持[16]。本研究中18例实性型AM有5例SOX2表达阳性，SOX2在单囊型AM和实性型AM之间、AM与含牙囊肿之间的表达差异无统计学意义，推测SOX2在AM中可能并不参与肿瘤的侵袭性，也可能与本文选取样本量较小、阳性表达病例较少，无法明确探索SOX2在AM中真正意义，其是否参与干细胞特性的维持有待于进一步研究。

在成釉细胞瘤中有干细胞标志物P75NTR的表达，且均表达于紧邻基底膜的柱状上皮细胞中，考虑其与肿瘤细胞的增殖相关。实性型AM、单囊型AM的不同表达方式，推测其可能与肿瘤的生物学行为相关。在多种恶性肿瘤中，SOX2对细胞干性维持有重要作用，但在AM中表达较少，其在AM中的作用有待于进一步探讨。