氧化石墨烯纳米银复合物对变异链球菌抗菌作用的研究

诸晓丹，何剑亮，唐子圣，漆正楠，石雨婷，夏文君，沈妙莲，邹 岩，吕 敏

变异链球菌(Streptococcusmutans，S.mutans)是口腔内主要的致龋菌，其强致龋性与其产酸、耐酸及其对牙面的选择性粘附能力有关。在口腔环境内，菌斑生物膜是细菌粘附于牙面，并在其上进行复杂代谢从而导致口腔疾病的一个独立的微生态系统。菌斑生物膜是造成龋病的始动因子。因此，探寻一种能有效抗菌并抑制生物膜形成的抗菌剂是目前龋病防治中的重点和热点。

银被用作抗菌剂已有悠久历史，纳米银(silver nanoparticles，AgNPs)因其特殊的纳米材料特性而具有更好的物理抗菌性[1-2]。然而，AgNPs不稳定，易发生氧化和自身团聚而影响其抗菌性能[3-4]。氧化石墨烯(graphene oxide，GO)是石墨烯的衍生物之一，其本身具有一定的抗菌性[5-7]并且能够负载多种抗菌材料，如纳米银、纳米铜和纳米氧化锌等形成各种纳米复合物，这些复合物具备更强的抗菌性能[8-10]。已有研究发现，氧化石墨烯纳米银复合物(graphene oxide-silver nanocomposites，GO-Ag)对金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus，S.aureus)、大肠杆菌(Escherichiacoli，E.coli)等多种细菌均有良好的抗菌作用[11-13]，但其作用于口腔致龋菌的研究较少。

因此，本研究主要探讨GO-Ag对变异链球菌的抗菌作用及其对生物膜形成的抑制作用，为其将来能应用于口腔龋病防治提供更多的理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

GO-Ag由中科院上海应用物理研究所制备提供。使用改良Hummers法[14]制备GO。将3.6 mmol/L硝酸银在不断搅拌下加入到0.5 g/L的GO中混匀，将混合物与1 mL 1%的柠檬酸钠在超声下混匀，缓慢加入硼氢化钠溶液(0.2 mol/L，60 mL)，用0.5 mol/L氢氧化钠调整pH值为11后进行离心，将沉淀物置于无菌去离子水中进行超声分散后得到所需的GO-Ag悬浊液。原液浓度为0.45 g/L。将GO-Ag原液置于紫外光中消毒，4 ℃保存备用。

1.2 菌液配制

国际标准菌株S.mutans(UA159)由上海交通大学医学院附属第九人民医院口腔微生物实验室提供。将冻存的菌株接种于胰蛋白大豆琼脂(tryptic soy agar，TSA)培养基上，37 ℃厌氧(N280%，H210%，CO210%)培养24 h。取单菌落置于5 mL胰蛋白大豆肉汤(tryptic soy broth, TSB)培养基中培养，绘制细菌生长曲线，取对数生长期菌液，配制初始浓度为1×107CFU/mL的菌液备用。

1.3 GO-Ag对浮游状态变异链球菌的抗菌作用

1.3.1 菌落形成单位(colony forming unit，CFU)计数法 取制备的菌液250 μL，加入无菌生理盐水及GO-Ag原液，配制形成500 μL含有GO-Ag终浓度分别5、10和20 mg/L的菌液，同时以无菌生理盐水作为阴性对照组，每个浓度组重复3次，37 ℃厌氧培养2 h。取适量菌液进行10倍梯度稀释后涂布于TSA培养基表面，37 ℃厌氧培养48 h后进行菌落计数，计算抗菌率。

1.3.2 流式细胞术(flow cytometry，FCM)检测活菌浓度 取制备的菌液250 μL，加入无菌生理盐水及GO-Ag原液，配制形成500 μL含有GO-Ag终浓度分别5、10和20 mg/L的菌液，并以无菌生理盐水作为阴性对照组，每个浓度组重复3次，37 ℃厌氧培养2 h。使用活菌/死菌荧光染色试剂盒(LIVE/DEAD BacLight Bacterial Viability Kits)中的SYTO9和PI染色剂进行荧光染色后，置于流式细胞仪中检测。

1.3.3 活死菌荧光染色法 取制备的菌液250 μL，加入无菌生理盐水及GO-Ag原液，形成500 μL含有GO-Ag终浓度为20 mg/L的菌液，同时以无菌生理盐水作为阴性对照组，每组重复3次，37 ℃厌氧培养2 h。按照活菌/死菌荧光染色试剂盒说明进行染色后，置于激光共聚焦扫描显微镜(confocal laser scanning microscope，CLSM)下观察。

1.4 GO-Ag抗变异链球菌生物膜作用

1.4.1 体外变异链球菌生物膜的培养 将制备的含有1%蔗糖的菌液与GO-Ag混匀，形成含有GO-Ag终浓度分别5、10、20 mg/L的菌液，并以无菌生理盐水作为阴性对照组，吸取100 μL加入96孔板中，每个浓度组重复3次，37 ℃厌氧培养24 h。

1.4.2 变异链球菌生物膜形成量的测定 将上述培养了24 h的变异链球菌生物膜弃去上清，使用无菌去离子水洗涤3次，每孔加入150 μL 0.1%的结晶紫溶液，室温下染色15 min，吸去染液，加入无菌去离子水洗涤3次，自然干燥后每孔加入200 μL 95%的乙醇，振荡溶解15 min，使用酶标仪测定590 nm处的吸光度，计算生物膜形成量减少率。

1.5 统计学方法

应用SAS 8.2统计软件进行统计分析，采用单因素方差分析(One-Way ANOVA)及Dunnett’st检验比较各实验组分别与对照组间的差异，检验水准α=0.05。

2 结 果

2.1 GO-Ag对浮游状态变异链球菌的抗菌作用

采用CFU计数法检测GO-Ag对变异链球菌的抗菌作用，结果见图1。当GO-Ag浓度为5、10、20 mg/L时，其对变异链球菌的抗菌率分别为(51.82±6.21)%、(84.94±4.67)%、100%，与对照组间的差异均具有统计学意义(P<0.05)，并且抗菌作用随着GO-Ag的浓度增大而增强。

*：P<0.05

采用FCM检测经过GO-Ag作用后变异链球菌的活菌浓度结果，见图2。当GO-Ag浓度为5、10、20 mg/L时，其活菌密度分别为(98.66±15.21)/mL、(61.35±4.83)/mL、(26.93±1.09)/mL，而对照组的活菌密度为(215.40±33.09)/mL,各实验组与对照组间的差异有统计学意义(P<0.05)。

*：P<0.05

采用活死菌荧光染色在CLSM下观察GO-Ag作用下变异链球菌的生存状态，见图3，其中绿色荧光代表活菌，红色荧光代表死菌。图中可见经过20 mg/L的GO-Ag处理2 h后的变异链球菌，红色荧光比例与对照组相比明显增加。

A：对照组；B：20 μg/mL GO-Ag处理组

2.2 GO-Ag对变异链球菌生物膜形成的抑制作用

采用结晶紫染色法测定变异链球菌24 h生物膜的形成量，结果见图4。与对照组比较，经过5、10、20 μg/L的GO-Ag处理后，变异链球菌生物膜形成量分别减少了(30.92±13.94)%、(58.39±6.73)%、(73.82±1.32)%，均有统计学差异(P<0.05)。

*：P<0.05

3 讨 论

龋病是一种慢性细菌感染性疾病，是人类两大口腔疾病之一。变异链球菌与龋病的发生发展密切相关，因此探寻有效抑制或杀灭变异链球菌的抗菌剂一直以来都是龋病防治领域的重要研究方向。近年来，面对传统抗菌剂带来的不良反应和耐药问题，新型无机纳米抗菌剂受到广泛关注和研究。

过去已有许多研究都报道了GO-Ag具有显著的抗菌性，如De Moraes等[15]研究发现15 μg/mL的GO-Ag分别作用于大肠杆菌和耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(Methicillin-resistantStaphylococcusaureus，MRSA)2 h和4 h就能完全杀死细菌；Jaworski等[16]同样报道了GO-Ag作用于大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和表皮葡萄球菌(Staphylococcusepdermidis,S.epdermidis)24 h后，其活性分别降低了88.6%，79.5%和76.5%。

此外，有研究报道了使用GO-Ag作为钛表面涂层，对变异链球菌和牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonasgingivalis，P.gingivalis)具有有效的抗菌作用，为将来预防种植体周围炎提供了一个新的方向[17]。另一方面，GO-Ag还可作为载药系统，将其他抗菌药物，如抗生素等负载于其上，发挥协同抗菌作用，进一步提高抗菌效率[18]。

本研究结果显示，当GO-Ag浓度为5 mg/L时，其对变异链球菌即有明显的抗菌作用，抗菌率为(51.82±6.21)%；而当其浓度达到20 mg/L时，TSA培养基上未见菌落生长，抗菌率达到100%。此外，FCM的结果显示经过20 mg/L的GO-Ag作用2 h后，变异链球菌活菌密度为(26.93±1.09)/mL，相比于对照组的(215.40±33.09)/mL下降了(87.35±1.48)%。活死菌染色法的检测结果则直观地表明了经过GO-Ag作用后，变异链球菌中的死菌比例明显增多。上述实验结果说明GO-Ag对浮游状态的变异链球菌具备良好的抗菌性。

以往研究报道GO-Ag的抗菌性强于GO与AgNPs[19-20]。本课题组研究发现20 mg/L的GO对变异链球菌的抗菌率为(55.9±10.7)%，明显小于GO-Ag[21]。Song等[22]研究认为GO-Ag的抗菌性并不是GO与AgNPs抗菌作用的简单相加，而是二者发挥协同抗菌作用，主要是通过破坏细菌细胞膜和介导氧化应激进行抗菌。GO具有较大的比表面积和大量含氧官能团，使AgNPs稳定分散在其表面，大大增加了与细菌的接触，进一步增强了抗菌性。

细菌生物膜由细菌群体和胞外物质组成，具有特殊三维立体结构，其比浮游状态的细菌抗药性更强、危害更大。本研究采用结晶紫染色法测定GO-Ag对变异链球菌24 h生物膜形成量的影响。结果表明经过5、10、20 mg/L的GO-Ag处理后，变异链球菌生物膜形成量分别比对照组减少(30.92±13.94)%、(58.39±6.73)%、(73.82±1.32)%，说明GO-Ag能有效地抑制变异链球菌生物膜的形成。实验结果与以往相关研究一致[23]。然而，目前对于GO-Ag对细菌生物膜的作用机制尚无定论。Liu等[24]认为GO-Ag能够通过调节铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa，P.aeruginosa)生物膜的胞外基质而有效抑制其生物膜形成。Kulshrestha等[23]则认为GO-Ag是通过杀灭浮游的阴沟肠杆菌(Enterobactercloacae，E.cloacae)而抑制其形成生物膜的；GO-Ag抑制变异链球菌形成生物膜则是通过调节与变异链球菌形成生物膜相关基因的表达实现的。

综上，本研究结果显示GO-Ag对变异链球菌有明显的抗菌作用，并能有效地抑制其形成生物膜。然而，GO-Ag的抗菌机制及其对细菌生物膜的作用还需更进一步研究，为其将来能够应用于临床提供更多依据。