磷酸酸蚀和不同磷酸酯单体预处理牙釉质表面的微观形态学观察和粗糙度评价

韩 菲，陈 晨，杨家雪，石 炜，景双林，谢海峰

磷酸酸蚀是牙釉质粘接前的表面处理经典程序[1-3]。然而酸蚀-冲洗技术存在操作费时，处理后易重新污染等缺点[4]。在此背景下，自酸蚀粘接剂被开始应用于牙釉质的粘接，其中包含了酸性单体实现牙釉质的脱矿和调节，而无需进行磷酸酸蚀预处理，因此能缩短工作时间和降低技术敏感性[5-6]。由于自酸蚀粘结剂的酸性比磷酸低，被质疑是否能提供足够的牙釉质脱矿能力[7]。目前关于酸蚀-冲洗和自酸蚀粘结系统对牙釉质与树脂间粘接强度的影响已有研究，但关于不同酸蚀时间和不同表面处理的牙釉质表面粗糙度和表面形貌的研究较少。本实验的目的即探讨磷酸酸蚀不同时间以及不同磷酸酯单体预处理牙釉质表面粗糙度和微观形态的影响。

1 材料与方法

1.1 材料

经南京医科大学伦理委员会批准，征得个人知情同意后从南京医科大学附属口腔医院收集7颗新鲜拔除的无龋人类第三磨牙，保存在4 ℃ Hanks平衡盐溶液中，并在1个月内使用。使用低速切割机(Buehler公司，美国)在流水状态下将牙齿沿釉牙骨质界分开，去除所有牙根。将牙冠在牙体长轴方向沿近远中向切开，制备成19个相同规格(3 mm×3 mm×2 mm)的牙釉质样本，使用钨钢车针(FG7664，美国)进行表面高度抛光。选取7个牙釉质样本分别接受以下表面处理：对照组：不进行进一步处理(Ctr)；酸蚀组：分别使用35%磷酸(格鲁玛，德国)酸蚀3 s(Etch3组)、15 s(Etch15组)、30 s(Etch30组)、60 s(Etch60组)；磷酸酯单体调节组：按照厂家推荐，分别涂抹含甘油磷酸二甲基丙烯酸酯(glycerol phosphate dimethacrylate，GPDM)的Optibond Versa (OV， Kerr，美国)的预处理剂(OV组)和含10- 甲基丙烯酰氧癸二氢磷酸酯(10-Methacryloyloxydecyl dihydrogen phosphate，10-MDP)的Tetric N Bond Universal (TNBU，义获嘉，列支敦士登)(TNBU组)各20 s，吹匀，自然挥发20 s。

在没有光固化的情况下，OV和TNBU组用丙酮和去离子水交替清洗，去除残留单体。所有样本在乙醇水溶液中逐级脱水。干燥后备用。

1.2 扫描电镜表面形貌观察

将各组经过表面处理的牙釉质样本进行溅射镀金，使用扫描电子显微镜(TESCAN， MAIA3，捷克)在真空状态下，工作电压为5 kV，工作距离为8 mm下进行微观形态学观察，放大倍数分别在2 000和 10 000倍。

1.3 表面粗糙度测定

剩余12个牙釉质样本，分为4组(n=3)，分别进行钨钢车针抛光、35%磷酸酸蚀15 s、OV预处理剂和TNBU表面处理，使用表面轮廓仪(Contour GT-X 3D optical microscope，Bruker公司，美国)进行表面粗糙度(Ra)的测定。

1.4 统计学方法

记录各组的粗糙度值，通过正态分布和方差齐性检验后，采用单因素方差分析比较不同表面处理因素对牙釉质表面粗糙度的影响。LSD检验进行组间比较。统计软件为SPSS 22.0(IBM SPSS Inc，美国)，显著性为0.05。

2 结 果

2.1 表面形貌

根据扫描电镜观察(图1～3)，经过钨钢车针抛光的牙釉质表面可见车针打磨的清晰划痕。低倍视野下，用磷酸酸蚀3 s的牙釉质表面可见较明显的鱼鳞状排列的釉柱，高倍视野下可以观察到釉柱结构轻度溶解，釉柱间质轻微暴露。磷酸酸蚀15 s的牙釉质表面在低倍视野下观察到由于釉柱溶解而显示出明显的蜂窝状图案，高倍视野下表现出类似于触须样的结构。磷酸酸蚀30 s的釉柱结构在低倍视野下表现出比酸蚀15 s相对平坦、聚合的图案，高倍视野下可观察到釉柱结构轻微塌陷，釉柱间隙较酸蚀15 s增大。磷酸酸蚀60 s的牙釉质表面在低倍视野下观察到的釉柱排列方式发生了变化，部分釉柱结构不再立体，高倍视野下可观察到釉柱结构明显塌陷,釉柱间隙较酸蚀30 s明显增大且大小不一。OV预处理剂处理过的牙釉质表面在低倍视野下划痕明显消失，高倍视野下可以观察到明显的釉柱边界。TNBU未见明显的釉柱蚀刻表现，划痕明显。

A： ×2 000；B: ×10 000

2.2 表面粗糙度

不同处理方式后牙釉质平均表面粗糙度(Ra)及标准差如表1所示。统计分析显示：Etch15组的Ra值最高，TNBU组的Ra值最低，用磷酸处理牙釉质产生的表面粗糙度显著大于Ctr组、OV组和TNBU组(P<0.001)，OV组明显高于TNBU组(P=0.032)，OV组和TNBU组都显著高于对照组(P<0.001)。图4～7为经过钨钢车针抛光(Ctr)、35%磷酸酸蚀15 s(Etch15)、OV预处理剂、TNBU处理过的牙釉质表面的典型三维图像。

A、a: 酸蚀3 s；B、b：酸蚀15 s；C、c: 酸蚀30 s;D、d: 酸蚀60 s。A、B、C、D： ×2000； a、b、c、d: ×10 000

A、a: Optibond Versa预处理剂；B、b: Tetric N Bond Universal, A、B: ×2 000； a、b: ×10 000

表1 牙釉质表面粗糙度

图4 钨钢抛光处理后牙釉质表面三维形貌图

图5 35%磷酸酸蚀15 s后牙釉质表面三维形貌图

3 讨 论

牙釉质是人体内最坚硬的组织，由92%～96%的无机物以及4%的有机物组成。无机物质的主要成分是羟基磷灰石晶体[8-9]。牙釉质微观结构由排列成棱柱或棒状，大致垂直于釉牙本质界的釉柱组成[10]。1955年，Buonocore引入了对牙釉质进行磷酸蚀刻以将丙烯酸类树脂粘接到酸蚀表面的概念，认为适当的牙釉质表面粗糙结构对于在粘接剂和牙釉质之间建立持久的粘结非常重要[11-12]。

图6 Optibond Versa预处理剂处理后牙釉质表面三维形貌图

图7 Tetric N Bond Universal处理后牙釉质表面三维形貌图

酸蚀-冲洗模式是牙釉质-树脂粘结的传统方式，也是当前应用最广泛的方式。磷酸蚀刻会溶解牙釉质羟基磷灰石晶体，并在表面形成多孔的固位结构，从而增加表面粗糙度和表面自由能。酸蚀-冲洗模式获得粘接力的来源即依赖于酸蚀的釉柱和羟基磷灰石晶体结构与渗入、包裹的粘接树脂聚合后形成的微树脂突[2]。酸蚀技术最初应用于牙釉质时，标准的酸蚀时间为60 s，但后来的研究发现，15 s的磷酸酸蚀已能为牙釉质表面提供足够的微机械固位力，进一步酸蚀或许可使牙釉质表面粗糙度(Ra)有统计学意义的增加，但形态特征和表面积并没有明显变化[11，13]。牙釉质-树脂的粘结耐久性并不与磷酸酸蚀时间存在相关性[14]，过度延长的磷酸酸蚀时间并不能提高牙釉质-树脂的剪切粘结强度[3]。因此，本研究中只测量了酸蚀15 s这一推荐的磷酸酸蚀时间，因其已能够代表磷酸酸蚀实现牙釉质表面粗糙度的较好状态，并将此作为对照，评价磷酸酯单体包含的粘接产品调节牙釉质时获得表面粗糙度的优劣。

本研究中的不同磷酸酸蚀时间的牙釉质表面形貌观察结果显示，酸蚀牙釉质3 s即可见釉柱结构轻度溶解，釉柱间质轻微暴露，酸蚀15 s的牙釉质表面则表现出由于釉柱溶解而明显的蜂窝状图案。这些现象与以往的研究[15]是一致的。酸蚀30 s的釉柱结构则出现轻微塌陷，釉柱间隙较酸蚀15 s者增大。酸蚀60 s的釉柱结构表现出明显的塌陷,釉柱间隙也较酸蚀30 s时明显增大。这可能是因为酸蚀时间过长而破坏了蜂窝状的有利于微机械嵌合的釉柱结构，这种结构显然不利于牙釉质-树脂的粘结强度和耐久性。

由于自酸蚀粘接系统产生的牙釉质表面与用磷酸处理的牙釉质表面明显不同[16-17]，磷酸酸蚀被认为使粘结树脂能够比未酸蚀和自酸蚀粘结剂处理的牙釉质表面渗透得更深入[18]，所以自酸蚀粘结剂与牙釉质产生的粘结力被质疑可能不如酸蚀-冲洗系统持久[19]。使用磷酸酸蚀可以明显改变牙釉质表面特性，与磷酸酸蚀相比，自酸蚀粘结剂对牙釉质的蚀刻能力则主要取决于所含的酸性功能单体的性质。有研究证实，10-MDP对牙釉质的脱矿能力相对于磷酸酸蚀较差，导致晶体间粘结树脂浸润较浅，微树脂突形成较少[20]。本研究中使用两种粘结剂Optibond Versa 和Tetric N Bond Universal分别代表两种功能单体GPDM和10-MDP对牙釉质的蚀刻能力，两者成分的主要差别是TNBU含有D3MA(decandiol dimethacrylate)和MCAP(methacrylated carboxylic acid polymer)。到目前为止，没有证据显示10-MDP与羟基磷灰石的脱矿及结合能力会受TNBU中D3MA和MCAP成分的影响。本研究中，高倍视野下的扫描电镜观察显示，与经典的磷酸酸蚀15 s在牙釉质表面暴露出的典型蚀刻图案相比，OV预处理剂处理20 s的牙釉质表面虽然没有显示出跟前者一样典型的蜂窝状结构，但是仍然暴露出一些釉柱结构，证实了钨钢车针制备的牙釉质表面划痕大部分被溶解，釉柱轮廓轻微暴露，部分被单体钙盐沉积所遮挡，最接近于磷酸酸蚀3 s时的效果。而TNBU与牙釉质相互作用时，在高倍镜下仍可观察到明显划痕，说明其蚀刻效果低于OV。这一现象主要是归因于OV预处理剂中的酸性单体GPDM(pH=1.6)对釉柱的蚀刻能力虽然低于酸蚀组(pH<0.5)，但是仍然产生了实现微机械嵌合力所需要的表面微观形态。TNBU所含的10-MDP(pH介于2.5～3.0)对牙釉质的蚀刻能力低于OV，所以推测提供的微机械固位力也低于OV。以往研究认为，含GPDM的自酸蚀粘结剂比含10-MDP的呈现出更多更深的蚀刻凹坑状结构，这些结构都被粘结树脂渗透，紧密包围着暴露的羟基磷灰石晶体，在牙釉质釉柱之间形成了丰富的微观和宏观树脂突[20]。这与本研究的结果是一致的。在本研究中，表面粗糙度分析结果也支持扫描电镜的观察结果。酸蚀15 s获得了最高的牙釉质表面粗糙度，其次是OV和TNBU，均高于对照组，因此，磷酸酸蚀在获得足够的牙釉质脱矿深度上仍是具有更大优势的。同时，OV预处理所表现出的脱矿深度明显大于TNBU，说明了磷酸酯单体的pH值对牙釉质表面的脱矿能力有关键作用。

通过当前的研究结果可以推论：牙釉质粘结推荐酸蚀-冲洗模式，磷酸酸蚀牙釉质时间以15 s为宜。经过磷酸酸蚀和应用磷酸酯单体包含的预处理剂调节均可以改变牙釉质表面特性，增加表面粗糙度，但磷酸酯单体GPDM对牙釉质的蚀刻能力和脱矿深度均高于10-MDP，提示相应的自酸蚀粘结剂可能更利于牙釉质-树脂的粘结效果。