铁离子沉积在急性CO中毒迟发性脑病白质脱髓鞘中的作用

高叶，韩琴，雷蕊绮，蒋力，扶孟，严湘，李经伦

急性一氧化碳（CO）中毒是临床上常见的中毒原因之一。有10%～30%患者在经历2～6周的“假愈期”后，出现以认知功能障碍等为主的一系列神经精神症状，称为急性CO中毒迟发性脑病（delayed encephalopathy after acute carbon monoxide poisoning，DEACMP），其发病机制尚未完全明确，但白质弥漫性的脱髓鞘改变是其最常见的病理变化之一［1］，且白质进行性脱髓鞘被认为是引发DEACMP机制之一［2］。铁离子除了参与氧气的运输、DNA等物质合成外，还参与了神经髓鞘的合成［3］。少突胶质细胞（OLs）是主要的含铁细胞，也是中枢神经系统髓鞘形成细胞，在髓鞘的形成和修复中起着关键的作用。研究发现过量沉积的铁离子可通过氧化应激等途径损伤OLs和髓鞘结构［4］。同时，新生儿缺血缺氧性脑损伤（HIBD）后可观察到在白质脱髓鞘区出现明显的铁沉积现象［5-6］；而在使用铁离子螯合剂后，HIBD动物迟发性脑损伤明显缓解［7］。DEACMP也存在迟发性脑损伤，但铁离子沉积与DEACMP白质脱髓鞘的关系暂不明确。因此，本研究通过建立DEACMP大鼠模型并检测其脑组织内铁离子、铁蛋白（Fn）、OLs特异性表达蛋白2′，3′-环核苷酸磷酸二酯酶（CNPase）以及髓鞘碱性蛋白（MBP）的动态变化探讨铁离子沉积在DEACMP发病机制中的作用。

1 材料与方法

1.1实验动物及材料 SPF级成年雄性健康SD大鼠165只，体质量220～300 g，购自成都达硕实验动物有限公司，动物许可证：SCXK（川）2019-030；99.9%体积分数的CO气体购自西南化工研究所；Morris水迷宫跟踪分析系统由西南医科大学公共卫生学院提供；去铁胺（DFO）试剂购自瑞士诺华制药有限公司；兔源 MBP抗体（ab62631）、Fn抗体（ab45688）、CNPase抗体（ab227218）和GAPDH一抗均购自Abcam公司；辣根过氧化物酶（HRP）标记羊抗兔抗体和苏木素染液购自Aspen公司；DAPI染液及抗荧光淬灭封片剂购自武汉阿斯本生物技术有限公司；DAB显色试剂盒购自北京中杉金桥生物技术有限公司；血气分析仪购自雅培公司；显微镜购自OLYMPUS公司。

1.2方法

1.2.1分组及造模 将经水迷宫实验筛选后的165只大鼠按随机数字表法分为：空气对照组（AC组）、CO中毒组（CO组）、DFO+CO中毒组（DC组），每组50只；每组再分为5个亚组，即染毒1、3、7、14、21 d组，另取备用大鼠15只。将大鼠称质量后，CO组、DC组大鼠首剂腹腔注射CO气体100 mL/kg，后每隔4 h追加注射50 mL/kg CO气体3次，AC组按同等间隔时间注射等量的空气。DC组在造模前1 h腹腔注射去铁胺100 mg/kg，造模后每日1次，直到处死；AC组、CO组每日给予相应体积生理盐水腹腔注射。染毒后于各时间点使用血气分析仪检测大鼠股动脉碳氧血红蛋白（HbCO）浓度。

1.2.2Morris水迷宫实验检测大鼠学习记忆能力 水迷宫实验主要分为定位航行（检测大鼠学习能力）和空间探索（检测大鼠记忆能力）。定位航行实验：将水迷宫设置4个象限，把平台随机定于任一象限，平台高出水面1.5 cm，将大鼠头朝池壁中点分别从4个象限放入水中，记录大鼠从入水至爬上平台时间，每次时间设定为120 s。如若大鼠在120 s内未找到平台，则逃避潜伏期为120 s。空间探索实验前撤去平台，记录大鼠在120 s穿过目标平台所在象限次数。实验前连续训练大鼠6 d，淘汰有认知功能障碍的大鼠。各组大鼠再分别于染毒前及染毒3、7、14、21 d行上述两项检测，记录数据。

1.2.3标本采集 各组大鼠于染毒相应时间点行水迷宫实验后，将大鼠麻醉，一半数量的大鼠进行心脏灌注、固定取脑白质，制成石蜡切片用于染色；另一半分离出新鲜脑白质用于Western blot检测。

1.2.4HE染色观察细胞形态 常规包埋切片，切片脱蜡至水，苏木素染色细胞核，伊红染色细胞质，脱水封片观察大鼠染毒14 d时神经细胞形态学变化。

1.2.5普鲁士蓝染色观察铁离子表达 组织包埋、切片，切片脱蜡至水，经染铁元素染色后水洗，再置于核固红染液浸染、水洗，最后脱水封片。400倍显微镜下观察，每张切片用随机数字表法取皮质区5个不重叠视野，用Image Pro plus 6.0软件计算其平均吸光度值，进行分析。

1.2.6Western blot检测Fn、MBP蛋白表达 白质区脑组织加入蛋白提取试剂，冰浴后均浆，4℃12 000 r/min离心5min，收集上清，用BCA测定蛋白浓度加入蛋白上样缓冲液，95～100 ℃沸水浴5 min，经凝胶电泳，转膜、封闭，加入Fn（1∶500）、MBP（1∶1 000）和GAPDH（1∶10 000）一抗4 ℃过夜孵育，TBST洗膜3次后加入HRP标记的二抗（1∶10 000）室温孵育30 min，TBST漂洗4次，再化学发光检测、处理分析目标带的灰度值。

1.2.7免疫组化染色检测CNPase蛋白表达 切片脱蜡水化、经PBS液冲洗后置于EDTA缓冲液中微波修复冷却，再放于3%过氧化氢液中室温下避光孵育10 min，PBS漂洗甩干后置于5%BSA中封闭20 min，加入CNPase（1∶200）4 ℃过夜，HRP标记的二抗（1∶200）室温孵育50 min，DAB显色冲洗后苏木素复染、乙醇分化、氨水返蓝、梯度乙醇脱水干燥后封片镜下观察。显微镜下每张切片在皮质区随机读取5个视野进行观察，用Image Pro plus 6.0软件分析视野内阳性区域的平均吸光度值。

1.2.8免疫荧光染色检测MBP蛋白表达 切片脱蜡水化、经PBS液冲洗后置于EDTA缓冲液中微波修复冷却，再放于3%过氧化氢液中室温下避光孵育10 min，PBS漂洗甩干后置于5%BSA封闭20 min，加入MBP（1∶1 000）一抗4℃过夜，HRP标记的二抗（1∶10 000）37 ℃孵育50 min，漂洗后加50～100μL DAPI染液，室温避光孵育5 min，滴加抗荧光淬灭剂，荧光显微镜下观察。

1.3统计学方法 采用SPSS 25.0软件进行统计学分析，计量资料以均数±标准差（±s）表示；水迷宫实验数据采用重复测量方差分析，余数据采用单因素方差分析，组间多重比较采用LSD-t法，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 大鼠行为学表现及HbCO浓度检测结果 首剂染毒后多数大鼠出现烦躁不安、冲撞鼠笼，大鼠口唇及四肢皮肤黏膜可见樱桃红色改变，少数则表现为精神萎靡，四肢瘫软；追加CO气体剂量后，大鼠陆续出现四肢强直、抽搐，甚至昏迷、死亡。共8只死亡，其中CO组6只，DC组2只；死亡大鼠用备用大鼠采用相同造模方法补齐。染毒前各组大鼠动脉血HbCO浓度均小于1%，染毒后16 h内测得的CO组、DC组HbCO浓度持续大于50%。

2.2 Morris水迷宫实验结果 CO组大鼠染毒14 d、21 d的逃避潜伏期较造模前、染毒3 d、7 d明显延迟；染毒14 d、21 d，CO组、DC组逃避潜伏期较AC组延长，DC组逃避潜伏期较CO组缩短（P＜0.05），见表1。CO组大鼠在14 d、21 d时穿越平台次数较AC组及DC组明显减少（P＜0.05），见表2。

Tab.1 Comparison of escape latency at each time point between three groups of rats表1 3组大鼠各时间点逃避潜伏期比较 （n=3，s，±s）

Tab.1 Comparison of escape latency at each time point between three groups of rats表1 3组大鼠各时间点逃避潜伏期比较 （n=3，s，±s）

F时间=816.606＊＊，F组别=3184.379＊＊，F交互=211.442＊＊；＊＊P＜0.01，a与AC组相比，b与CO组相比，c与CO组内造模前及染毒3 d、7 d相比，P＜0.05

组别AC组CO组DC组造模前11.27±0.08 11.33±0.22 11.34±0.24 3 d 11.32±0.20 11.36±0.28 11.35±0.30 7 d 11.24±0.08 11.29±0.21 11.37±0.26 14 d 11.40±0.14 22.09±0.54ac 19.91±0.39ab 21 d 11.19±0.19 21.50±0.51ac 19.31±0.65ab

2.3 HE染色 光镜下可见AC组大鼠脑白质区神经元结构正常，核仁及核膜结构清晰，未见变性坏死细胞；CO组大鼠神经细胞随着染毒时间的推移发生变性、坏死，表现为神经元肿胀，胞体皱缩，核仁偏位，胞质深染，细胞核固缩、碎裂，胞质与胞核界限不清；DC组细胞变性、坏死介于AC、CO组之间，见图1。

Fig.1 The HE staining in white matter area at the 14th day(×400)图1 第14天白质区HE染色（×400）

Tab.2 Comparison of the number of platform crossing at each time point between three groups of rats表2 3组大鼠各时间点穿越平台次数比较（n=6，±s）

Tab.2 Comparison of the number of platform crossing at each time point between three groups of rats表2 3组大鼠各时间点穿越平台次数比较（n=6，±s）

F时间=19.129＊＊，F组别=21.735＊＊，F交互=3.543＊＊；＊＊P＜0.01，a与AC组相比，b与CO组相比，c与CO组内造模前及染毒3 d、7 d相比，P＜0.05

组别AC组CO组DC组造模前5.17±1.17 5.17±0.98 5.17±1.17 3 d 5.00±0.63 4.50±1.05 4.67±1.03 7 d 4.67±1.21 3.67±1.03 4.33±0.52 14 d 4.67±1.03 1.33±1.21ac 3.00±0.63ab 21 d 4.33±0.82 1.50±0.55ac 3.17±0.75ab

2.4 普鲁士蓝染色 CO组大鼠白质区铁离子被染成亮蓝色，呈团块样分布。AC组铁离子表达极少，各时间点间差异无统计学意义（P＞0.05）；CO组铁离子表达于染毒14 d达到高峰（P＜0.05）。与AC组比较，CO组、DC组铁离子表达增加；与CO组比较，DC组铁离子表达减少（P＜0.05），见图2、表3。

Fig.2 The prussian blue staining in white matter area at the 14th day(×400)图2 第14天白质区普鲁士蓝染色（×400）

Tab.3 The expression of iron detected by Prussian blue staining表3 普鲁士蓝染色检测铁离子表达情况 （n=3，±s）

Tab.3 The expression of iron detected by Prussian blue staining表3 普鲁士蓝染色检测铁离子表达情况 （n=3，±s）

＊＊P＜0.01；a与AC组相比，b与CO组相比，c与CO组内14 d相比，P＜0.05

组别AC组CO组DC组F 1 d 8.90±0.72 14.73±0.89ac 11.63±0.89ab 36.097＊＊3 d 8.47±0.61 21.98±1.61ac 14.89±1.82ab 65.245＊＊7 d 7.31±0.99 32.38±1.60ac 16.33±1.63ab 234.609＊＊组别AC组CO组DC组F 14 d 7.79±1.17 43.56±3.34a 19.12±0.93ab 224.612＊＊21 d 7.99±0.90 32.51±2.19ac 17.16±1.47ab 178.120＊＊F 1.407 83.697＊＊12.008＊＊

2.5 Western blot结果 CO组、DC组Fn表达均在7d达峰值，后逐渐减少；除1 d外，与AC组比较，CO组、DC组Fn表达增加；与CO组比较，DC组Fn表达减少（P＜0.05）。CO组大鼠于染毒3 d后MBP表达逐渐减少，14 d表达最少；与AC组比较，染毒3 d后CO组、DC组MBP表达减少；与CO组比较，染毒3 d后DC组MBP表达增加（P＜0.05），见图3。

2.6 CNPase免疫组化染色 CO组染毒14 d CNPase阳性表达最少（F=116.834，P＜0.05）。染毒7、14、21 d时，CO组、DC组CNPase表达较AC组减少（P＜0.05）；与 CO组比较，DC组在 14 d和 21 d CNPase表达增多（P＜0.05），见图4、表4。

2.7 MBP免疫荧光染色 MBP主要表达于白质髓鞘；染毒14 d时，CO组MBP表达较AC组明显减少，髓鞘排列稀疏且模糊；DC组MBP表达较CO组增加，髓鞘排列较密集，见图5。

Fig.3 The expressions of Fn and MBP in white matter area detected by Western blot assay图3 Western blot检测白质区Fn、MBP蛋白表达

Tab.4 The comparison of immunohistochemical results of CNPase between three groups表4 3组大鼠CNPase免疫组化结果比较 （n=3，±s）

Tab.4 The comparison of immunohistochemical results of CNPase between three groups表4 3组大鼠CNPase免疫组化结果比较 （n=3，±s）

＊＊P＜0.01；a与AC组相比，b与CO组相比，c与CO组内14 d相比，P＜0.05

组别AC组CO组DC组F 1 d 7.03±0.25 7.13±0.35c 6.93±0.45 0.231 3 d 7.37±0.81 6.83±0.40c 7.23±0.49 0.654 7 d 7.33±0.57 5.20±0.30ac 5.70±0.36a 20.620＊＊14 d 7.47±0.74 2.07±0.31a 4.33±0.47ab 76.946＊＊21 d 6.97±0.25 4.57±0.25ac 5.20±0.36ab 54.247＊＊

Fig.4 The immunohistochemical staining of CNPase in white matter area at the 14th day(×400)图4 第14天白质区CNPase免疫组化染色（×400）

Fig.5 The immunofluorescence of MBP in the brain white matter area at the 14th day(×400)图5 第14天脑白质区MBP免疫荧光染色（×400）

3 讨论

DEACMP发病机制复杂，尚不十分明确，可能是缺血缺氧、炎症与免疫反应、细胞凋亡、神经递质紊乱、脱髓鞘等多因素共同作用的结果［8］。本实验采用改良式腹腔注射CO气体方法制备DEACMP大鼠模型。染毒后大鼠出现典型的急性CO中毒表现，且体内HbCO浓度持续16 h以上超过50%，达到急性CO中毒标准［9］；染毒7 d、14 d神经元细胞变性、坏死明显，此时大鼠表现出显著的学习记忆功能下降；大鼠行为学表现晚于其病理学改变，与临床患者CO中毒后出现的迟发性脑病在时间及表现上基本一致，说明本实验造模成功。

脑内铁离子分布广泛，Fn是铁离子在细胞内最主要的储存场所，其稳态受缺氧、炎症、损伤、铁调素等多种因素影响［10］。脑组织发育过程中铁离子缺乏将导致不可逆的认知和行为障碍，而铁离子过量沉积可通过芬顿（Fenton）及哈伯·韦斯（Haber-Weiss）反应产生氧化毒性、内质网应激、线粒体功能障碍，增强凋亡信号等作用导致多种中枢神经系统疾病，如帕金森病、阿尔茨海默病等［11-12］。

OLs是中枢神经系统髓鞘形成细胞，CNPase特定表达于OLs，因此可通过对CNPase表达间接分析脑白质中OLs的变化。MBP是中枢神经髓鞘的主要髓磷脂蛋白（约占40%），其表达可以间接反映白质髓鞘纤维的变化；Wang等［13］研究发现，L-丝氨酸可通过促进白质内OLs分化和髓鞘再生进而改善小鼠的学习、记忆和认知功能。Zhang等［14］研究表明，喹硫平通过促进OLs的再生从而改善脱髓鞘模型小鼠的认知功能。以上研究表明，OLs的功能障碍及髓鞘结构的破坏可能是导致认知功能障碍的重要结构基础［15］。

有研究发现，在缺氧早期，铁离子增加可促进Fn表达，Fn可与铁离子结合，从而中和铁离子的氧化毒性［4］。而CO中毒晚期机体复氧后可使一氧化氮含量升高，诱导与Fn结合的铁离子从结合蛋白中游离出来，游离的铁离子可产生级联反应导致铁离子在脑组织内大量蓄积［16］。本研究中，在染毒前期（1 d、3 d），CO组大鼠铁离子表达逐渐增加的同时Fn表达也在增加；增加的铁离子和Fn结合，中和了铁离子的氧化毒性，减轻了OLs和髓鞘结构的损伤，CNPase表达无明显减少，MBP表达仅轻度减少，白质髓鞘丢失不明显，此时3组大鼠定位航行和空间探索实验结果相比均无差异，大鼠学习、记忆功能尚未受到损害。随着染毒时间的延长，在染毒后期（7、14 d），铁离子表达迅速增加，Fn表达开始减少，过量沉积的铁离子通过氧化应激、膜脂质过氧化、蛋白质变性降解等途径大量损伤OLs及减少髓鞘MBP表达，导致CNPase、MBP表达进行性减少，白质脱髓鞘明显，14 d、21 d水迷宫实验发现大鼠出现明显的学习记忆能力损伤，证实急性CO中毒后，过量沉积的铁离子可通过损伤OLs及减少MBP表达，导致大鼠脑白质进行性脱髓鞘，发生迟发性认知功能障碍。

DFO是一种可渗透血脑屏障的铁离子螯合剂，常用于清除脑内过量的铁离子［17］。本研究发现应用DFO显著降低染毒14 d、21 d大鼠脑内铁离子后，DC组大鼠OLs损伤减轻，CNPase和MBP表达增加，明显减轻了脑白质脱髓鞘，改善了大鼠的神经功能障碍表现，进一步证实了CO中毒后铁离子沉积参与了DEACMP的发生发展。

综上，CO中毒后可能通过铁离子沉积损伤OLs及减少MBP表达，引起白质进行性脱髓鞘，导致DEACMP发生。正常情况下，脑内铁离子受到严格的铁代谢调节，处于一种相对稳定状态。脑内铁离子的摄取、转运、输出、储存、细胞内代谢等都可以引起脑铁代谢变化［18］。本实验可观察到DEACMP大鼠脑铁离子表达增加，为防治DEACMP提供了新的治疗靶点，但铁离子在其中的具体转运调控机制还需进一步研究。

（图 1、2、4、5见插页）