唐山市苯丙酮尿症患儿筛查及PAH基因突变情况分析

鲁程绯，郭志义△，鲁弼嘉，李小倩，刘佳玮

苯丙酮尿症（phenylketonuria，PKU）是一种常见的新生儿氨基酸代谢障碍性疾病，属于常染色体隐性遗传疾病［1］。其发病机制主要是苯丙氨酸（phenylalanine，PA）代谢途中的苯丙氨酸羟化酶（phenylalanine hydroxylase，PAH）基因突变导致肝脏PAH缺乏或活性降低，使PA不能正常转化为酪氨酸而引发的代谢性疾病［2-3］。其主要临床表现为发育迟缓、精神亢进、智力低下等，极大地影响了患者的生理健康［4］。PKU可根据其血中PA浓度分为经典型和非经典型两种，其中经典型占PKU患者总数的90%［5］。由于PAH在不同种族和地区发生的基因突变存在差异，各个国家和地区均有其突变特点。据统计，我国PKU发病率约为1/11 000，且绝大部分患者由PAH基因突变引发［6-7］。PAH是一种具有催化活性的四聚体，可催化人体肝脏中的PA转化成酪氨酸，其编码基因由13个外显子（Exon）和12个内含子构成［8-9］。PKU前期症状不明显，容易被忽略。因此，在出生后需通过前期筛查预防性治疗才能避免病情恶化。本研究通过分析唐山市近4年来PKU患儿筛查结果，探讨新生儿PAH基因突变的情况。

1 对象与方法

1.1研究对象 收集2015年1月—2018年12月唐山市妇幼保健院新生儿筛查中心接收的303 777例新生儿PKU筛查结果，所有样本分别来自唐山市各市、县、镇级医院。其中男163 243例，女140 534例。

1.2筛查方法 在新生儿出生后3 d内，针刺采集足跟血于筛查滤纸上，晾干后通过茚三酮免疫荧光法检测足跟血中PA含量，试剂盒购于芬兰雷勃公司，相关操作严格按照说明书进行。若PA初筛浓度≥120 μmol/L，提示为可疑阳性，筛查人员通过电话或短信的形式通知可疑阳性患儿家长带回复查。若复查PA浓度仍≥120 μmol/L，则可确诊为PKU。

1.3聚合酶链反应（PCR）检测PAH基因 采用酚-氯仿提取外周血DNA，提取后置于-20℃保存。参照文献［10］进行PCR 扩增，引物序列：Exon2上游 5′-AGAGTTCATGCTTGCTTTG-3′，下游 5′-TGGAAGTTTGCTACGACAT-3′；Exon3上 游 5′-GTTAGGTTTTCCTGTTCTGGT-3′，下 游 5′-TGTGGAGTTACTTATGTTGCA-3′；Exon6上 游 5′-CCCCGACTC CCTCTGCTAA-3′，下游 5′-CCTCTGCCTCAATCCTCCC-3′；Exon7上 游 5′-GTCTCCTAGTGCCTCTGACT-3′，下 游 5′-GCAATGAACCCAAACCTC-3′；PCR扩增条件：95℃预变性5 min；95℃变性30 s，60℃复性30 s，73℃延伸50 s，共循环32次，72℃10 min。PCR产物经2%琼脂糖检测并纯化后委托生工生物工程（上海）股份有限公司进行双向测序。

2 结果

2.1 唐山市新生儿PKU筛查情况分析 303 777例PKU筛查的新生儿中，初步筛查结果有609例可疑阳性，共召回411例（67.49%）进行复查，确诊42例（13.8/10万）。见表1。

Tab.1 PKU screening of newborns in Tangshan from 2015 to 2018表1 2015—2018年唐山市新生儿PKU筛查情况

2.2 唐山市新生儿PAH基因突变情况分析 42例PKU患者的PAH基因测序显示，在84条染色体上共检测到62个（73.81%）突变位点。所有患者均检测出突变基因，其中20例患者检测出2个突变位点，22例患者检测出1个突变位点。所有患者共检测出12种突变，其中错义突变8种，无义突变2种，缺失突变1种，剪接突变1种。患者基因突变分布在第2、3、6、7、9外显子上，其中第7外显子最多，共35个（56.45%）；其次为第3外显子14个（22.58%）。唐山市常见突变基因分别为Exon7-R243Q（18个，29.03%）、Exon3-R111X（10个，16.13%）和 Exon7-R261Q（10个，16.13%）。见表2。

Tab.2 PAH gene mutation in Tangshan City表2 唐山市PAH基因突变情况

2.3 典型案例分析 1例女性患儿，在PAH基因外显子区域同时发现2处杂合突变：c.208-210delTCT（缺失突变），导致氨基酸改变p.S70del（缺失突变），根据美国医学遗传学与基因组学学会（ACMG）指南，该突变变异类型可评级为Pathogenic（致病突变）；c.964G＞A（鸟嘌呤＞腺嘌呤），导致氨基酸改变p.A322T（丙氨酸＞苏氨酸），根据ACMG指南，该突变变异类型可评级为Likely pathogenic（疑似致病突变）。见图1。

Fig.1 Sanger sequence of two gene mutations in a typical PKU child and his parents图1 1例典型PKU患儿及其父母的两个基因突变受检位点Sanger测序图

3 讨论

PKU是由遗传因素导致基因缺陷引发的遗传代谢性疾病，尤其是近亲结婚会增加下一代的发病风险。目前，基因诊断是产前诊断PKU的唯一方法，基因诊断能够有效避免PKU患儿的出生，及时发现并对已生育的PKU患儿加以治疗，从而缓解其病情［11-12］。现已知的PAH基因突变类型多种多样，其中以错义突变居多，约占60.08%，其次为缺失突变（13.35%）和剪切突变（11.03%）［13-14］。PAH基因突变类型、位点在不同种族和地区之间均有差异。目前发现PAH突变在每个外显子上均能发生，但主要集中在3、6、7和11外显子上，且随着地区的不同其发生频率也不同［15］。

本研究结果显示，唐山市在2015—2018年间共确诊PKU 42例，发病率为13.8/10万，略高于全国PKU发病率1/11 000。分析其原因之一为不同国家和地区的PAH突变类型、位点等诸多因素不同［16］。本研究中42例PKU患儿84条染色体上共检测到62个（73.81）突变。患儿PAH基因中共检测到12种突变 ，以 Exon7-R243Q（29.03%）、Exon3-R111X（16.13%）和 Exon7-R261Q（16.13%）为主。其中R243Q在本市患儿中出现频率最高，与国内大部分研究［17］相一致，但出现频率相对高于报道的河南地区人群（18.14%）［18］和新疆地区人群（21.8%）［19］，提示R243Q是我市PKU患儿的突变热点基因。本研究结果显示，患儿PAH基因突变多出现于第7外显子上，共35次（56.45%），与其他国内外研究［20］结果相一致，说明第7外显子也是我市患儿PAH基因高频突变位点。

本研究结果发现1例典型病例，该患儿在PAH基因外显子区域出现2处杂合突变：c.208-210delTCT（缺失突变），导致氨基酸改变p.S70del（缺失突变），根据ACMG指南，该突变变异类型可评级为Pathogenic（致病突变）；c.964G＞A（鸟嘌呤＞腺嘌呤），导致氨基酸改变p.A322T（丙氨酸＞苏氨酸），根据ACMG指南，该突变变异类型可评级为Likely pathogenic（疑似致病突变）。查阅相关文献，暂未发现与本案例相一致的报道。

综上，唐山市2015—2018年PKU发病率为13.8/10万，略高于全国发病率，PAH基因变异以错义突变为主，且第7外显子是唐山市患儿PAH基因高频突变位点，R243Q出现频率最高且高于国内其他地区。