高尿酸对心肌细胞活力的影响及其相关机制探讨

刘迪丹，高凯，谢扬，李智

高尿酸血症（hyperuricemia，HUA）是嘌呤代谢紊乱引起的一种代谢性疾病，随着人们生活水平的逐渐提高，HUA患病率也显著升高。临床上，高尿酸血症与多种心血管疾病密切相关，包括心房颤动［1］、缺血性心脏病［2-3］、心力衰竭［4-5］等，但高尿酸血症与心血管疾病之间关系的分子机制仍未明确。正常水平的尿酸具有抗氧化作用，然而近年研究发现高尿酸在体内外可诱导血管内皮细胞［6］、肾小球系膜细胞［7］、泡沫细胞［8］等靶细胞氧化应激，并导致内皮细胞损伤、肾损伤、胰岛素抵抗和炎症反应。对于心肌细胞，高尿酸能否通过引起氧化应激进而影响其活力，相关研究较少。MAPK（mitogen-activated protein kinase）信号途径是许多细胞外刺激作用的重要信号传导通道，包括细胞外调节蛋白激酶（extracellular regulated protein kinases，ERK）、P38和c-Jun三条途径，是将信号从表面受体传导至细胞核的关键，负责调节细胞生长、增殖、凋亡、损伤等病理生理过程。已有研究表明，活性氧（reactive oxygen specie，ROS）可调节ERK/P38信号级联反应，并导致细胞去分化和炎症反应［9］。然而，高尿酸是否可通过氧化应激干扰心肌细胞ERK/P38信号通路进而影响心肌细胞活力仍不清楚。本研究旨在观察高尿酸在体外对心肌细胞活力的影响，并对其可能的相关机制进行探讨。

1 材料与方法

1.1主要试剂与仪器 H9c2大鼠心肌细胞标本（CRL-1446）购自美国Manassas，VA公司。3-（4，5-二甲基-2-噻唑基）-2，5-二苯基四唑溴化物（MTT）、2，7-二氯二氢荧光素二乙酸酯（DCFH-DA）ROS荧光探针、尿酸、PD98059（ERK抑制剂）和胰酶购自美国Sigma Aldrich公司。兔抗鼠磷酸化/总ERK（P-ERK/T-ERK）抗体、兔抗鼠磷酸化/总P38（P-P38/TP38）抗体购自美国Cell Signaling公司；兔抗鼠GAPDH和SB203580（P38抑制剂）购自英国Abcam公司；辣根过氧化酶标记的山羊抗兔二抗购自美国Santa Cruz公司。N-乙酰半胱氨酸（NAC，抗氧化剂）购自美国ENZO Life Sciences公司。细胞培养基DMEM高糖、胎牛血清购自Gibco公司；BCA蛋白质测定试剂盒购自美国Pierce公司；ECL化学发光试剂盒（32106）购自赛默飞世尔生物技术有限公司；PVDF膜购自上海Millipore公司。CO2细胞培养箱（MCO-15AC）购自SANYO公司；倒置显微镜（CX41）购自日本OLYMPUS公司。SDSPAGE微型凝胶电泳及转膜设备购自美国BIO-RAD公司。全自动化学发光图像分析系统（Tanon-5200）购自上海天能科技有限公司；低温高速离心机（3k30）购自德国Sartorius公司。

1.2方法

1.2.1细胞培养 以含DMEM高糖、10%胎牛血清（FBS），加入1%青霉素G 100 U/mL、链霉素100 g/L双抗的培养基中培育H9c2大鼠心肌细胞，于恒温37℃，5%CO2的条件下培养，待细胞长至80%～90%，使用胰酶消化离心后，将细胞以2.0×105个/mL接种在6孔板中继续孵育，待细胞贴壁后进行后续细胞实验。

1.2.2尿酸母液及各浓度抑制剂制备 将尿酸溶至0.5 mol/L NaOH中，制备成15 g/L的母液，使用时用DMEM培养基稀释即可。NAC（抗氧化剂）制备为5 mmol/L，PD98059（ERK抑制剂）制备为20 mmol/L，SB203580（P38抑制剂）制备为100nmol/L，为后续实验使用。

1.2.3实验分组及干预 实验分空白对照组（Con组）、高尿酸组（HUA组）、抗氧化剂组（NAC组）、ERK抑制剂组（PD98059组）、P38抑制剂组（SB203580组）、高尿酸+抗氧化剂组（NAC+HUA组）、高尿酸+ERK抑制剂组（PD98059+HUA组）、高尿酸+P38抑制剂组（SB203580+HUA组）以及高尿酸+抗氧化剂+ERK抑制剂组（NAC+PD98059+HUA组）。Con组不作任何处理，加入等量的培养基，HUA组将心肌细胞与0.15 g/L尿酸在新鲜细胞培养基中孵育24 h，NAC组加入5mmol/L的NAC预处理30 min，PD98059组加入20 mmol/L的PD98059预处理30 min，SB203580组加入100 nmol/L的SB203580预处理30 min，NAC+HUA组在加入尿酸作用前，使用5 mmol/L的NAC预处理30 min，PD98059+HUA组在加入尿酸作用前，使用20 mmol/L的PD98059预处理30 min，SB203580+HUA组在加入尿酸作用前，使用100 nmol/L的SB203580预处理30 min，NAC+PD98059+HUA组在加入尿酸作用前同时加入5 mmol/L的NAC和20 mmol/L的PD98059预处理30 min，收集细胞用于生物化学或分子测定。所有实验至少重复3次。

1.2.4MTT法测定H9c2心肌细胞的活力 将细胞以4 000个/孔接种到96孔板中，分别以0、0.05、0.10、0.15 g/L的尿酸量及不同的作用时间（12、24、48和72 h）对心肌细胞进行处理，以确定最佳尿酸实验水平及作用时间；待细胞贴壁后，弃去培养基并向每个孔中加入150 μL MTT溶液（0.5 g/L）并在37℃下孵育4 h。除去MTT溶液并加入150 μL DMSO使紫色结晶充分溶解，使用酶标仪在492 nm处测量各孔OD值，以OD值大小代表细胞活力情况，将处理细胞的光密度标准化，并与对照细胞（0 g/L）的光密度进行比较，所有实验至少重复3次。

1.2.5免疫荧光染色及流式细胞仪测定细胞内的ROS水平 将细胞传代培养6孔板（2.0×105个/孔），使其贴壁后，使用高尿酸0.15 g/L处理24 h，NAC、NAC+HUA组在高尿酸作用前30 min预处理同1.2.3，高尿酸处理后弃去培养基，使用10 mmol/L DCFH-DA对心肌细胞染色，在37℃环境下作用30 min，然后通过荧光显微镜对Con组、HUA组、NAC组及NAC+HUA组染色的细胞进行成像，并使用流式细胞仪（激发和发射波长为530 nm和480 nm）对染色细胞的平均荧光强度进行定量分析，得出细胞内的ROS水平，表示细胞的氧化压力，实验至少重复3次。

1.2.6Western blot检测ERK及P38的蛋白表达水平 将细胞裂解液（RIPA）加入蛋白酶抑制剂（1 mmol/L苯甲烷磺酰氟，PMSF）和磷酸酶抑制剂（磷酸酶抑制剂混合物I）混匀，放入细胞培养皿中裂解30 min，收集细胞进行超声处理，12 000 r/min离心15 min，最后弃沉淀，取上清液。通过使用BCA法测定上清液蛋白质浓度，然后将余蛋白样品加4×蛋白上样缓冲液，金属浴100℃变性5 min。取适量蛋白样品在10%SDS-PAGE分离蛋白（60 V 40 min，110 V 55 min），湿转（200 mA，90 min）将蛋白转移至PVDF膜上，用5%脱脂牛奶阻断其他非特异性蛋白，孵育一抗过夜，P-ERK（1∶1 000），P-P38（1∶1 000），T-ERK（1∶1 000），T-P38（1∶1 000），GAPDH（1∶10 000），然后孵育二抗1 h（1∶10 000），抗原抗体结合完毕后，使用ECL显影液曝光，最后通过使用数字图像处理系统获得Western blot图像，并使用Image J软件进行半定量分析，所有实验至少重复3次。

1.3统计学方法 采用SPSS 20.0软件进行统计分析，符合正态分布的计量资料以±s表示，2组间比较采用独立样本t检验，多组间均数比较采用单因素方差分析，组间多重比较采用LSD-t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 高尿酸对H9c2心肌细胞活力的影响 经高尿酸处理后，心肌细胞活力呈剂量依赖性下降趋势，且在尿酸为0.15 g/L时，细胞活力在各时间点较其他剂量下降最为明显。0.15 g/L尿酸处理不同作用时间，细胞活力在24 h和48 h分别降低21%和32%，见图1，后续实验选取0.15 g/L尿酸为最佳实验剂量。

2.2 高尿酸处理对心肌细胞ROS的影响 Con组、HUA组、NAC组、NAC+HUA组氧气压分别为11.650±3.977、55.300±9.069、8.300±1.985及26.300±4.060，组间比较差异有统计学意义（n=4，F=61.980，P＜0.01），HUA组的氧化压力较Con组明显上升，而NAC+HUA组的氧化压力较HUA组下降（P＜0.05），见图2。

2.3 各组心肌细胞活力比较 与Con组相比，HUA组心肌细胞活力水平明显下降（P＜0.05），而与HUA组相比，NAC+HUA组、PD98059+HUA组及SB203580+HUA组的心肌细胞活力均上升（P＜0.05），见图3。

2.4 各组心肌细胞内ERK及P38表达比较 与Con组比较，HUA组ERK的磷酸化水平明显增加（P＜0.05），与HUA组相比，NAC+HUA组、PD98059+HUA组、NAC+PD98059+HUA组ERK的磷酸化水平明显下降（P＜0.05）；与Con组比较，HUA组P38的磷酸化水平明显增加（P＜0.05），与HUA组相比，NAC+HUA组、PD98059+HUA组、NAC+PD98059+HUA组、SB203580+HUA组P38的磷酸化水平明显下降（P＜0.05），见图4。

Fig.1 The activity levels of cardiomyocytes detected by MTT assay图1 MTT法检测心肌细胞活力水平

Fig.2 Results of immunofluorescence staining and flow cytometry for intracellular ROS levels图2 免疫荧光染色及流式细胞仪测定细胞内ROS水平

Fig.3 The activity levels of cardiomyocytes detected by MTT assay in each group图3 MTT法测定各组心肌细胞活力水平

Fig.4 The expressions of ERK and P38 phosphorylated protein in cardiomyocytes detected by Western blot assay图4 Western blot检测各组心肌细胞中ERK、P38磷酸化蛋白表达情况

3 讨论

高尿酸作为代谢性疾病受到越来越多的关注，2018年欧洲《高尿酸血症和高心血管病风险患者的诊断和治疗专家共识》提出，高尿酸血症与心血管疾病风险增加密切相关，可预测心血管病死亡、高血压或糖尿病等疾病的风险［10］，表明高尿酸血症完全有可能直接通过影响心肌细胞进而导致相关心血管疾病的发生发展。本研究通过采用高尿酸刺激H9c2细胞建立实验模型，结果发现与Con组相比，高尿酸刺激后细胞活力明显降低，且刺激了ROS的生成。ROS是当细胞受到有害刺激时发生异常代谢所产生的，它作为第二信使在多种靶细胞中介导基因转录、细胞增殖、坏死、凋亡和分化等过程［11］。Zhang等［12］发现高尿酸能引起心肌细胞内ROS增加并激活NLRP3炎性小体，进而引起心肌损伤。Sun等［13］也发现高浓度的尿酸可直接引起鸡的心肌细胞的氧化损伤。本研究中在高尿酸刺激下，大鼠心肌细胞的氧化压力明显增加，ROS水平明显回升，而在NAC+HUA组中，氧化压力较HUA组明显降低，细胞活力水平明显上升，表明高尿酸可以直接作用于心肌细胞，并引起细胞内氧化应激，而氧化应激如何进一步影响心肌细胞活力，其作用机制可能与促进激活ERK及P38通路相关。

MAPK通路是细胞增殖、应激、炎症、分化、功能同步化、转化、凋亡等信号转导通路的共同交汇通路之一，可将胞外信号经受体、G蛋白/小G蛋白、蛋白激酶、转录因子等组成的信号网络传递到胞内，参与细胞增殖、分化、癌变、转移、凋亡等，不同的生长刺激、应激刺激，在不同的细胞，经不同细胞骨架局限的不同信号通路，可产生多种效应［13］。而ERK和P38是MAPK中的两条关键的信号通路，ERK广泛存在于各种组织中，参与细胞增殖分化的调控，而P38则介导细胞内的炎症、凋亡等过程［14］。有研究表明，细胞应激下产生的ROS可激活ERK和P38信号通路，进而影响靶细胞的增殖、分化及凋亡等［15-16］。为阐明ERK和P38通路是否参与了高尿酸抑制心肌细胞活力的过程，本研究建立了ERK抑制剂+高尿酸（PD98059+HUA）组及P38抑制剂+高尿酸（SB203580+HUA）组，发现其与HUA组相比，心肌细胞活力有所恢复，表明ERK及P38可能参与了高尿酸抑制心肌细胞活力的过程，这也与Zha等［17］发现高尿酸在肾小管细胞通过氧化应激激活ERK通路的结果一致；进一步采用Western blot检测到与Con组相比，HUA组的ERK和P38的磷酸化水平明显增加，与HUA组相比，PD98059+HUA组的ERK和P38的磷酸化水平明显下降，SB203580+HUA组的P38磷酸化水平也明显下降，表明心肌细胞在高尿酸刺激下，激活了ERK和P38 MAPK信号通路。因此，高尿酸刺激后，心肌细胞的活力下降与ERK和P38 MAPK信号通路的激活密切相关，这可能是高尿酸引起心肌损伤的机制之一。

综上所述，高尿酸可以引起心肌细胞氧化应激，激活ERK和P38 MAPK信号通路，进而抑制心肌细胞活力。不少研究表明心肌在受到缺血再灌注等有害刺激时，也同样会激活ERK通路［13，18］。这与本研究中高尿酸作为一种有害刺激作用于心肌细胞时，引起细胞的氧化应激，进而激活ERK信号通路是一致的。而使用NAC、ERK抑制剂及P38抑制剂干预后均可明显逆转高尿酸对心肌细胞活力的抑制，保护心肌细胞免受损伤。因此早期阻断这一过程可能有助于改善高尿酸血症相关代谢性心脏病的预后。