血红素氧合酶-1对哮喘小鼠模型IL-25和MUC5AC表达的影响

詹倩，杜丽君，戴曦，袁竞，刘贲，王荣丽△

支气管哮喘（asthma）是一种由多种细胞及细胞组分参与的气道慢性炎症性疾病，是最常见的慢性呼吸系统疾病之一，有3亿多儿童和成人患病［1］。哮喘的具体机制尚不完全清楚，免疫反应导致树突状细胞、T淋巴细胞、B淋巴细胞、嗜酸性粒细胞、肥大细胞等浸润气道黏膜下层，产生一系列病理过程是目前的主流观点［2］。白细胞介素（IL）-25在哮喘气道炎症中发挥重要作用。IL-25不仅可诱导典型的嗜酸性炎症和气道高反应性［3］，还可促进杯状细胞增生、上皮下胶原沉积和血管生成，最终导致气道重构［4］，杯状细胞增生是导致气道黏液高分泌的重要环节。过度产生的黏蛋白聚集在气道导致阻塞，显著增加哮喘患者，尤其是重症患者的病死率［5］。血红素氧合酶-1（hemeoxygenase，HO-1）是血红素分解代谢的限速酶，也是一种应激反应蛋白［6］，广泛参与机体炎症反应，具有抗氧化，保护重要组织、器官和细胞的功能［7］。然而，HO-1在哮喘中的抗炎作用机制尚不完全清楚。血晶素是一种高效HO-1敏化剂，能有效促进体内HO-1的释放和表达。本实验通过观察血晶素在哮喘小鼠模型中的作用，进一步探讨HO-1与IL-25诱导的气道炎症和黏液高分泌的关系，以期发掘新的哮喘病理机制和诊疗靶点。

1 材料与方法

1.1实验材料 6～8周龄SPF级雌性Balb/c小鼠28只，体质量18～22 g，购自重庆腾鑫比尔实验动物有限公司，在西南医科大学SPF级动物实验室饲养，维持室温在（22±1）℃、相对湿度40%～50%，昼夜光照节律，自由进食及饮水。卵清蛋白（OVA）、血晶素（Hemin）均购自美国Sigma公司；福多司坦片（Fudosteine）购自江苏正大丰海公司；兔抗鼠黏蛋白5AC（MUC5AC）多克隆抗体、生物素化山羊抗兔IgG购自北京博奥森公司；IL-25、MUC5AC酶联免疫吸附测定（ELISA）试剂盒均购自中国上海西唐生物公司；酶标仪购自美国Thermo公司；高速离心机购自美国Sigma公司；光学显微镜购自日本OLYMPUS公司；BQ-318石蜡切片机购自湖北伯纳医疗公司。

1.2方法

1.2.1实验分组 将28只小鼠根据随机数字表法分成4组：对照组、哮喘组、血晶素组、福多司坦组，每组7只。

1.2.2干预方案 （1）哮喘组、血晶素组和福多司坦组小鼠于第1天和第14天腹腔注射 20 μg OVA+500 μg Al（OH）3+0.2 mL PBS致敏，第25、26、27、28天，将小鼠置于封闭的塑料盒（26 cm×19 cm×17 cm）中，用5%OVA溶液经超声雾化吸入激发气道高反应制备小鼠哮喘模型，每日1次，每次持续30min，对照组均以等量生理盐水代替。（2）血晶素组致敏前1、2 d，致敏后12、13、23、24、27 d腹腔注射血晶素75 μmol/kg。（3）福多司坦组分别于致敏前25、26、27 d灌胃给药福多司坦（200 mg/kg）。

1.2.3标本收集 各组小鼠于末次激发后24 h内用戊巴比妥钠腹腔注射麻醉，眼眶取血并处死小鼠，收集的血液于4℃，1 500 r/min条件下离心10 min，取上清液置于-80℃冰箱保存；左肺组织以4%多聚甲醛固定用于HE染色及免疫组化染色；右肺组织保存于-80℃冰箱备用。

1.2.4组织病理学观察 左肺组织用4%多聚甲醛固定24h，标本脱水、石蜡包埋、5 μm连续切片，常规行HE染色，显微镜下观察病理形态学改变。

1.2.5免疫组化染色检测肺组织中MUC5AC的表达 取处死后小鼠肺组织，用4%多聚甲醛磷酸盐缓冲溶液固定48 h，流水冲洗30 min后，梯度乙醇脱水，石蜡包埋、切片，采用链霉素过氧化物酶（SP）法，抗原修复后，滴加兔抗鼠抗MUC5AC抗体（1∶100）4℃孵育过夜，室温复温漂洗后，滴加生物素标记二抗37℃孵育30 min，PBS冲洗3次，DAB显色，复染、脱水、透明封片后光镜下观察MUC5AC表达情况，以胞浆棕黄染色为阳性反应，应用Image-Pro Plus图像处理系统测量MUC5AC的平均吸光度值。

1.2.6ELISA法检测IL-25、MUC5AC表达水平 将ELISA试剂盒于室温下放置半小时，取出预先冻存于-80℃冰箱的血清和肺组织，置于冰上融化，按照ELISA试剂盒说明书操作测定血清中IL-25表达水平。每份肺组织中加入1 mL PBS，置于研钵中，冰上研磨肺组织，收集匀浆，4℃，1 500 r/min条件下离心20 min，收集上清。按照ELISA试剂盒说明书操作测定肺组织中MUC5AC的水平。

1.3统计学方法 采用SPSS 22.0进行统计学处理，计量数据采用均数±标准差（±s）表示，多组样本间的比较采用单因素方差分析，组间多重比较采用LSD-t检验，相关性分析采用Pearson相关分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组肺组织形态学改变观察 对照组气道上皮结构完整，未见明显结构改变及炎症细胞浸润。哮喘组肺组织可见大量炎症细胞浸润、气管黏膜增厚、黏膜下水肿。血晶素组和福多司坦组可见少量炎症细胞浸润及渗出，病理改变较哮喘组轻，见图1。

2.2 免疫组化染色检测各组肺组织MUC5AC的表达 与对照组相比，哮喘组肺组织MUC5AC的表达明显增加（P＜0.05）。在支气管、支气管上皮细胞、气道基底层、肺泡间隔血管周围呈黄色、棕色或褐色强阳性表达；与哮喘组相比，血晶素组和福多司坦组肺组织黄染明显减弱，MUC5AC的表达明显降低，且血晶素组较福多司坦组降低更明显（P＜0.05），见图2、3。

Fig.1 Histological observation of lung tissues of mice(HE,×200)图1 各组小鼠肺组织形态学观察（HE，×200）

Fig.2 The expressions of MUC5AC in lung tissues of mice(IHC,×200)图2 各组肺组织中MUC5AC的表达情况（免疫组化，×200）

Fig.3 The average OD-value of MUC5AC positive expression cells in lung tissues of mice in each group by immunohistochemical staining图3 各组小鼠肺组织免疫组化染色MUC5AC阳性表达细胞的平均光密度值

2.3 ELISA法检测各组肺组织MUC5AC和血清IL-25水平 与对照组相比，哮喘组、血晶素组、福多司坦组MUC5AC和IL-25的表达水平明显升高（P＜0.05）；与哮喘组相比，血晶素组和福多司坦组MUC5AC和IL-25降低，且血晶素组较福多司坦组降低更明显（P＜0.05），见表1。

Tab.1 Contents of IL-25 in serum and MUC5AC in lung tissues表1 各组肺组织MUC5AC和血清中IL-25含量（n=7，ng/L，±s）

Tab.1 Contents of IL-25 in serum and MUC5AC in lung tissues表1 各组肺组织MUC5AC和血清中IL-25含量（n=7，ng/L，±s）

＊P＜0.05；a与对照组比较；b与哮喘组比较；c与血晶素组比较，P＜0.05

组别对照组哮喘组血晶素组福多司坦组F MUC5AC 79.27±9.85 238.90±14.15a 107.32±8.86ab 154.94±13.44abc 245.945＊IL-25 45.90±6.22 175.25±10.60a 77.91±10.05ab 116.45±10.82abc 234.822＊

2.4 MUC5AC与IL-25的相关性分析 MUC5AC与IL-25的表达水平呈正相关（r=0.932，P＜0.01），见图4。

Fig.4 The correlation analysis of MUC5AC in lung tissue and IL-25 in serum图4 血清中IL-25和肺组织中MUC5AC的相关性分析

3 讨论

哮喘被认为是由2型辅助性T细胞（Th2）介导的免疫功能紊乱引起，可导致气道慢性炎症、黏液分泌过多和细胞凋亡［8-9］。其中，气道黏液高分泌是许多哮喘患者的共同特点，黏液阻塞被认为是致死性哮喘气道阻塞的机制之一［10］。因此，减少气道黏液的产生和分泌是控制和治疗哮喘的重要手段。HO-1是热休克蛋白（HSP）家族的一员，其生理功能与血红素分解代谢中的酶活性有关，其抗氧化和抗炎特性在多种炎症疾病中发挥着不可或缺的作用［11］。近年来，越来越多的研究显示，HO-1可减轻肺和其他器官的过敏性炎症，抑制Th2和Th17细胞分化［12-13］。Chen等［14］发现，HO-1可能通过氧化应激途径、转录因子和免疫细胞功能介导变态反应。HO-1不仅具有抗炎作用，还可通过靶向哮喘的促炎性核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3-视黄醇X受体（NLRP3-RXR）轴保护气道上皮细胞免于凋亡［15］。Lee等［16］研究发现HO-1的上调可减弱OVA诱导的哮喘小鼠活性氧的产生。但目前HO-1对于哮喘小鼠黏蛋白表达的影响研究较少。本研究结果显示，与哮喘组比较，血晶素组及福多司坦组气道炎症细胞与管腔分泌物明显减少，气道上皮结构相对完整，黏膜下水肿减轻，提示血晶素及福多司坦可改善支气管哮喘气道炎症及黏液分泌，减轻哮喘炎症反应。

慢性气道炎症和黏液高分泌是哮喘气道重塑的主要病理标志，导致严重哮喘患者的肺功能降低和死亡风险增加［17-18］。黏液是由一种被称为黏液素的高度糖基化的蛋白质组成，其中MUC5AC和黏蛋白5B（MUC5B）是参与哮喘的主要黏液素［19-20］。研究发现MUC5AC在哮喘患者气道内的表达水平呈持续上升，是导致气道黏液高分泌的主要因素［21］。在尘螨致敏的小鼠哮喘模型中，MUC5AC也有增加［22］。因此，抑制气道黏液的高分泌及气道重塑可能是哮喘治疗的目标。本研究结果显示，哮喘状态下小鼠的MUC5AC表达明显增加，而血晶素治疗后，MUC5AC的表达减少，提示血晶素能在一定程度上抑制MUC5AC，表明HO-1调控哮喘气道炎症与重塑的机制可能是通过抑制MUC5AC表达实现的。

研究表明，通过刺激，气道上皮释放相应的炎症介质、抗菌肽（如IL-25、IL-33、IL-13、IL-5、胸腺基质淋巴细胞生成素等），参与氧化应激、气道高反应、黏液高分泌和气道重塑［23］。IL-25是IL-17细胞因子家族的成员，主要通过白细胞介素17B型受体（IL-17RB）发挥作用。IL-25参与包括哮喘在内的多种气道慢性炎症疾病，可通过诱导气道炎症、气道杯状细胞变性、黏液高分泌、气道高反应性，从而进一步促进气道重构［24］。Gregory等［25］发现抗IL-25单克隆抗体可减轻尘螨诱发的哮喘性气道炎症反应，减轻气道重构。本研究结果显示，哮喘状态下小鼠血清中IL-25的水平明显升高，这与Zhang等［26］研究结果一致。而经血晶素或福多司坦处理后，IL-25的表达减少，提示血晶素及福多司坦能在一定程度上抑制IL-25的表达，且血晶素较福多司坦作用明显，表明HO-1可能通过抑制IL-25的表达，减轻哮喘气道炎症。笔者推测这种潜在的可能机制为：维持气道对氧化应激的不敏感性，减少炎症细胞的浸润；HO-1抑制促炎因子的产生，从而防止触发和放大炎症效应，减轻气道炎症。但本研究并未探讨HO-1对哮喘小鼠气道重构改善的影响，有待进一步研究。

综上所述，HO-1可降低MUC5AC及IL-25的表达，具有改善哮喘小鼠气道炎症反应，减轻哮喘气道黏液高分泌及炎症损伤的作用，其作用机制可能与IL-25介导的炎症反应信号通路密切相关，但具体机制尚未完全明确，还需要进一步的深入研究。

（图1、2见插页）