降胆固醇红曲霉的分离筛选及培养条件研究

李洪淼

（辽宁农业职业技术学院，辽宁 营口 115009）

近年来，心血管疾病的发病率呈快速上升趋势，大量研究成果表明，高胆固醇膳食与心血管疾病发病率有关系，降低胆固醇含量可相应减少冠心病的发病率和死亡率[1-3]。由此可见，维持体内胆固醇的含量在正常水平对人体的健康至关重要。

红曲中含有莫纳可林K 等生理活性物质，具有降胆固醇、降血压、降血糖等功能[4]，可以做保健食品和药品。但红曲发酵产率低，因此分离筛选降胆固醇能力强的红曲霉菌株，并对其培养条件进行研究，探索最佳的发酵条件，对于开发研究降脂食品和药品意义重大。本实验以市售的红曲米为原料，从中分离筛选红曲霉菌株，并进行培养条件研究，旨在为降脂成分的规模化发酵生产提供数据支撑和经验参考。

1 试验材料与方法

1.1 试验材料

市售红曲。

1.2 培养基

麦芽汁培养基：取一1 000 ml烧杯，加入100 g麦芽粉和300 ml 蒸馏水，置于水浴锅中65℃糖化完全后，补失水，纱布过滤，加入2%琼脂粉，溶解，调pH 至4.5～5.5，121℃灭菌20 min备用。此种培养基用于红曲霉的平板分离。

马铃薯葡萄糖琼脂培养基：取去皮的马铃薯小块200 g，加入蒸馏水1 000 ml，加热煮沸维持20～30 min，两层纱布过滤，弃去滤渣并将滤液补足水到1 000 ml。加入20 g 葡萄糖，20 g 琼脂，溶解，调pH5.5，121℃灭菌20 min 备用。用于红曲霉的活化、保存。

MEA 培养基：配方参照李钟庆等[5]。用于红曲霉菌株的鉴定。

发酵培养基：在1 000 ml 蒸馏水中加入胆固醇0.3 g，葡萄糖70 g， KH2PO41.5 g，MgSO4·7H2O 0.5 g， NaNO32 g， ZnSO42 g，牛肉膏15 g， 加热溶解，调pH 5.0，121℃灭菌20 min备用。用于红曲霉菌株的培养条件研究。

1.3 试验方法

1.3.1 红曲霉筛选

将10 g 红曲放入装有少量玻璃珠的90 ml 生理盐水中振荡20 min，得到红曲霉的原菌液。在无菌条件下将原菌液梯度稀释到10-4、10-5、10-6 三种梯度，各取1 ml 稀释液放入麦芽汁固体平板培养基中，采用涂布棒均匀涂布培养基表面，30℃倒置培养4 d。挑取单一菌落，在麦芽汁培养基上再次分离纯化，培养，这样反复几次，得到纯培养的菌株，编好号，将其接种于马铃薯葡萄糖琼脂斜面上，4℃下短期保藏。

1.3.2 分解胆固醇能力鉴定

胆固醇降解定性分析采用铁矾显色剂显色法[6]：筛选出的纯菌株经活化后分别接种到麦芽汁液体培养基中，相同条件下培养相同时间，得到种子液。以5%接种量分别接入含蛋黄6 g/1 000 ml的麦芽汁培养基中[7]，30℃培养5 d。取2 ml 菌株发酵液于试管中，加入0.2 ml 的铁矾显色剂显色，与接种前的麦芽汁培养基比较，通过颜色的深浅分析判断菌株是否具有降解胆固醇的能力及能力大小，初步筛选得到分解胆固醇最强的红曲霉菌株。

1.3.3 红曲霉的形态鉴定

将降解胆固醇能力最强的菌株接种在MEA鉴定培养基上，培养，观察菌落形态特征，并用显微镜观察菌丝及孢子囊等特征，对其进行形态上的鉴定。

1.3.4 培养条件研究

接种量：将降胆固醇能力最强的菌株分别以2%、4%、6%、8% 、10%的接种量接种到发酵培养基，30℃分别连续培养10 d，以未接种培养基作对照，用分光光度计测定490 nm处的光吸收值（OD），以筛选最适宜的接种量。

发酵温度：将降胆固醇能力最强的菌株接种于发酵培养基，分别在2O℃、25℃、30℃、35℃连续培养10 d，以未接种培养基为对照，用分光光度计测定490 nm处的光吸收值（OD），以筛选最适宜的发酵温度。

初始pH：将降胆固醇能力最强的菌株接种于发酵培养基，分别在初始pH 为3、4、5、6、7、8 的培养基上30℃连续培养10 d，以未接种培养基为对照，用分光光度计测定490 nm处的光吸收值（OD），以筛选最适宜的培养基初始pH值。

2 试验结果

2.1 红曲霉的分离筛选

筛选到的红曲霉在麦芽汁平板上生长良好，培养初期菌落的颜色为白色，4 d后菌落中心变成粉红色，最后整个菌落变为红色。通过反复筛选得到4 株红曲霉，标号为M1，M2，M3，M4。

2.2 分解胆固醇能力鉴定

在含胆固醇的麦芽汁液体培养基中分别培养分离到的红曲霉，通过铁矾显色剂显色观察颜色变化情况。显色反应发酵液颜色深浅随着培养基中胆固醇浓度的变化而变化，胆固醇浓度越高，显色后颜色越深，反之，胆固醇浓度越低，显色后颜色越浅。在30℃下，分别静置培养4 d，并与未接种的培养基进行比较。依据铁矾显色剂显色反应分析判断降解胆固醇能力最强的菌株为M2。

2.3 红曲霉的形态鉴定

在固体培养基上，M2 菌株在MEA 培养基上30℃培养7 d，菌落直径20 mm，平坦，气生菌丝橙红色，短小，稀疏；25 d 直径达55 mm，棕色。通过显微镜观察发现其菌丝具有分枝，无横隔，多核。随着培养时间加长，菌丝会发生一些变化，表现为增粗，壁增厚，并由菌丝形成糖葫芦状的分生孢子。

2.4 培养条件研究

2.4.1 接种量研究

从图1可见，当接种量在2%～8%范围内时，随着接种量的增加，光吸收值在不断减小，说明培养液中胆固醇的含量在不断减少，当接种量为10%时，光吸收值有少量增加。因此，在一定范围内，增大接种量有利于红曲霉降解胆固醇。降解胆固醇能力最强的M2菌株的最适接种量为8%。

图1 接种量对胆固醇降解的影响

2.4.2 发酵温度研究

从图2可见，M2菌株在20℃～35℃范围内培养均能降解胆固醇，在20℃～30℃内，胆固醇的降解能力随着温度的升高而增大，但超过35℃，则降解能力下降。因此，M2菌株降解胆固醇的最适宜温度为30℃。

图2 培养温度对胆固醇降解的影响

2.4.3 初始pH研究

从图3 可以看出，培养基初始pH 对M2 降解胆固醇的能力有影响。当pH值在4～6范围内时，降解胆固醇的能力最强，且差异不大。因此，M2 菌株的生长最适宜初始pH为4～6。

图3 初始pH 对胆固醇降解的影响

3 结论

本试验从市售红曲中分离筛选四株红曲霉，通过铁矾显色剂显色法筛选出降解胆固醇能力最强的菌株M2，采用单因子试验进一步研究发现，M2降解胆固醇的最适宜的发酵条件：接种量为8%，发酵温度为30℃，发酵的初始pH值在4～6之间。