宫颈鳞状细胞癌对DDP和DDP+5-FU 的体外药敏检测及与耐药蛋白表达的关系研究△

苏丰丽，孔为民#，刘志茹，宋丹，卞丽红

1首都医科大学附属北京妇产医院妇瘤科，北京 100006

2北京美中宜和妇儿医院妇科，北京 100015

3解放军总医院第五医学中心妇科，北京 100071

子宫颈癌是全球女性第四大常见恶性肿瘤，约90%发生在中低收入国家[1]。2019年美国宫颈癌新增病例和死亡人数已呈下降趋势[2]，而在不发达国家宫颈癌的5年生存率仍不足50%[3]，严重威胁着女性健康，因此宫颈癌的治疗仍是全球医疗研究的热点。20世纪90年代，在发表了五项大型临床试验后，美国国家癌症研究所批准以顺铂为基础的同步放化疗成为中晚期宫颈癌的标准治疗方法。目前临床上同步放化疗的常用化疗方案为顺铂（cisplatin，DDP）和DDP+5-氟尿嘧啶（5-Fluorouracil，5-FU），这也是美国国家综合癌症网络（National Comprehensive Cancer Network，NCCN）指南所推荐的方案，但哪种方案疗效好还有争议，因此本研究采用三磷酸腺苷生物荧光法（triphosadenine bioluminescence tumor chemosensitivity assay，ATP-TCA）对这两种常用化疗方案进行药敏检测，比较其体外有效率。同时检测其耐药蛋白P糖蛋白（P-glycoprotein，P-gp）、谷胱甘肽 S-转移酶-π（glutathione S-transferase-π，GST-π）、DNA 拓扑异构酶Ⅱ（topoisomerasⅡ，TopoⅡ）、胸苷酸合成酶（thymidylate synthase，TS）的表达，分析化疗药物敏感性与耐药蛋白表达的关系，为临床预测化疗药物耐药提供依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料

收集2018年1月至2019年1月首都医科大学附属北京妇产医院初治的宫颈鳞状细胞癌患者的病历资料。纳入标准：经病理证实为宫颈鳞状细胞癌。排除标准：既往有放化疗史；合并心肝肾等重要脏器疾病；合并其他肿瘤。共纳入35例宫颈鳞状细胞癌患者，年龄29～71岁，中位年龄52岁；临床分期采用国际妇产科联盟标准：Ⅰ期14例，ⅡA期10例，ⅡB期8例，Ⅲ期2例，Ⅳ期1例；分化程度：高分化5例，中分化28例，低分化2例。取材前均经患者同意并签署知情同意书。

1.2 主要药物、试剂和仪器

DDP、5-FU血浆峰值浓度（peak plasma concentration，PPC）分别为：2.5μg/ml、22.5 μg/ml，根据参考文献[4-6]提供的PPC，100%试验药物浓度（test drug concentrations，TDC）为PPC。联合药物方案中每种药物的TDC与单药试验相同。

ATP-TCA法药敏检测试剂盒购自北京金紫晶生物医药技术有限公司；鼠抗人P-gp、GST-π、TopoⅡ、TS单克隆抗体，二氨基联苯胺（diaminobenzidine，DAB）显色试剂，EnⅤision二步法试剂盒均购自北京中杉金桥生物技术有限公司。MPL1型生物荧光测定仪购自德国Berthold公司。

1.3 实验方法

将新鲜宫颈癌组织分成两部分，其中一部分行快速病理及免疫组化检测耐药蛋白，另一部分立即送往无菌实验室，参考文献[7]的实验步骤制成单细胞悬液。将化疗药物分别设置5个稀释浓度，分别为200%、100%、50%、25%、12.5%，稀释至48孔板中，每孔设置2个平行孔，其余孔分别用于无药物处理和空白对照。在每个孔中加入单细胞悬液（2～3）×104/ml，将培养皿置于5% CO2、37 ℃、95%以上湿度的培养箱中培养5天。各孔加ATP提取液50 μl，混匀后取50 μl混合液于检测板，加入50 μl荧光酶-荧光素工作液，将检测板置于荧光检测仪内进行检测。荧光检测仪自动计算每种药物各个浓度的肿瘤生长抑制率、半抑制浓度（50% inhibiting concentration，IC50）和IC90，绘制肿瘤抑制曲线图，从而判定药物敏感程度。

1.4 肿瘤组织对化疗药物的敏感性检测

评价标准参考文献[8]。高度敏感（SS）：IC50≤25% TDC且IC90≤100% TDC；中度敏感（IS）：IC50≤25% TDC且IC90＞100% TDC；轻度敏感（MS）：IC50＞25% TDC 且 IC90≤100% TDC；耐药（R）：IC50＞25% TDC且 IC90＞100% TDC。体外有效率=（SS+IS）/（SS+IS+MS+R）×100%。

1.5 免疫组化法检测蛋白表达情况

采用EnⅤision二步法检测宫颈鳞状细胞癌中P-gp、GST-π、TS、TopoⅡ蛋白的表达情况，每批切片均设阳性对照及阴性对照，用已知P-gp、、GST-π、TS、TopoⅡ的阳性宫颈癌切片作为阳性对照，以磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline，PBS）代替一抗作为阴性对照。

1.6 免疫组化结果判定

P-gp、GST-π、TS蛋白的判定标准：“-”，阳性细胞＜10%；“+”，阳性细胞为10%～25%；“++”，阳性细胞＞25%且≤75%；“+++”，阳性细胞＞75%。TopoⅡ蛋白的判定标准：“-”，阳性细胞＜25%；“+”，阳性细胞为25%～50%；“++”，阳性细胞＞50%且≤75%；“+++”，阳性细胞＞75%。本研究以“-”为阴性，“+～+++”均为阳性。

1.7 统计学方法

采用SAS 9.4软件进行统计学分析，计数资料以例数及率（%）表示，组间比较采用χ2检验；多因素分析采用Logistic回归分析；以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 ATP-TCA体外药敏实验结果

35例标本均进行药敏实验，DDP的体外有效率为37.14%（13/35），与DDP+5-FU的51.43%（18/35）比较，差异无统计学意义（χ2=1.447，P＞0.05）（表1）。经多因素分析发现，患者年龄、临床分期、分化程度均不为DDP、DDP+5-FU药物敏感性的影响因素（P＞0.05）（表2）。

表1 宫颈鳞状细胞癌对两组化疗药物的体外药敏实验结果

表2 化疗药物敏感性影响因素的多因素分析

2.2 耐药蛋白表达与体外药物敏感性的关系

P-gp、GST-π、TopoⅡ、TS蛋白阳性表达率分别为57.14%（20/35）、51.43%（18/35）、71.43%（25/35）、57.14%（20/35）。GST-π蛋白阳性表达是宫颈鳞状细胞癌对DDP耐药的影响因素（P=0.002）；TS蛋白阳性表达是宫颈鳞状细胞癌对DDP+5-FU耐药的影响因素（P=0.001）；P-gp、TopoⅡ蛋白阳性表达与宫颈鳞状细胞癌对DDP、DDP+5-FU耐药敏感性无关（P＞0.05）。（表3）

表3 耐药蛋白表达与DDP、DDP+5-FU药物敏感性关系的多因素分析

3 讨论

3.1 宫颈鳞状细胞癌ATP-TCA 体外药敏实验的临床意义

ATP-TCA技术是目前应用较广泛、较成熟的一项的体外药敏检测方法。其原理是在生理条件下，ATP是活细胞能量代谢的来源，细胞凋亡后会迅速水解消失，而ATP在荧光素-荧光素酶复合物的作用下释放萤光（波长为562 nm），检测萤光强度，即可测出ATP含量即活细胞数量。研究表明，ATP-TCA的体外药敏检测结果与临床疗效及生存率具有较好的相关性[9]。化疗前对化疗药物进行体外药敏检测可有效预防原代耐药的发生和不适当药物的治疗[10-11]。本课题前期刘志茹和孔为民[12]的研究已证实ATP-TCA法用于检测宫颈癌体外药物敏感性具有可行性。

DDP与DDP+5-FU是临床中晚期宫颈癌同步放化疗中最常用的两种化疗方案，DDP与5-FU均具有放射增敏作用，在放化疗中起到协同及互补的治疗效果。DDP属于细胞周期非特异性药物，药物进入细胞核作用于DNA分子后可形成Pt-DNA化合物，阻断DNA的复制与转录过程，导致细胞死亡。DDP是浓度依赖性抗肿瘤药，浓度越高，疗效越好，而且在临床上宫颈癌治疗中顺铂的毒性可控[12]，较为安全。5-FU是细胞周期特异性抗代谢类抗恶性肿瘤药物，作用于细胞S期。近年来研究发现5-FU在体内可转变为5-FU脱氧核苷酸、5-FU核苷等代谢产物，从而影响或干扰DNA及蛋白质的合成，起到抗肿瘤作用。5-FU具有时间依赖性，持续给药能提高疗效。本研究结果显示，单药DDP体外有效率为37.14%（13/35），DDP+5-FU联合应用体外有效率为51.43%（18/35），联合用药体外有效率略高于单药，但差异无统计学意义（P＞0.05）。Kim等[13]一项随机对照试验，比较DDP+5-FU与单药DDP联合放疗治疗局部晚期宫颈癌（ⅡB～ⅣA期）的疗效，联合组、单药组患者3个月完全缓解率分别为96%和88%，4年总生存率分别为64%和54%，无病生存率分别为77%和66%。2级以上血液毒性发生率分别为29%和15%，两组患者反应性、生存率和急性毒性发生率比较，无显著差异。Kim等[14]的又一项前瞻性随机对照研究，纳入研究对象为155例局部晚期宫颈癌患者，比较DDP+5-FU与单药DDP联合放疗治疗局部晚期宫颈癌的疗效，随访时间39个月，两组患者的依从性分别为60%、71%，完全有效率分别为91%、91%，4年总生存率分别为70%、67%，无进展生存率分别为67%、66%，每周使用DDP周疗联合放疗方案可显著提高治疗依从性，降低急性血液毒性，但不能提高生存率。Sonoda等[15]回顾性分析了91例ⅠB1～ⅣA期同步放化疗的宫颈癌患者的病历资料，比较DDP+5-FU 3周疗法和DDP周疗的疗效，两种方案疗效相似，但DDP单药周疗的不良反应耐受较好。但是Nedovic等[16]对134例局部晚期宫颈癌患者的研究显示，DDP+5-FU联合放疗治疗比单纯DDP联合放疗更有效，2年复发率低。因此还需要大样本的前瞻性研究。

本研究发现DDP与DDP+5-FU体外药物敏感性与临床特征如患者年龄、临床分期、分化程度无关（P＞0.05）。由于本研究样本量偏少，统计结果可能出现偏倚，并且体外实验肿瘤细胞所处环境单一，肿瘤细胞完全浸泡于化疗药物中，而人体内环境相对复杂，药物入血后也产生一系列的不良反应，因此体外实验能否真正反映体内情况还需要进一步研究。

3.2 体外药物敏感性与耐药蛋白P-gp、GST-、TopoⅡ、TS 表达的关系

多项研究已表明，肿瘤组织中P-gp、GST-π、TS及TopoⅡ的表达与肿瘤耐药密切相关，其中以MDR1基因编码的P-gp就是一种多药耐药蛋白。Penson等[17]研究发现P-gP的高表达与肿瘤患者的生存率呈明显负相关。TopoⅡ是一种重要的核酶，能切断超螺旋状态的DNA双链，改变DNA拓扑学结构，参与DNA复制、转录、翻译等生理功能。TopoⅡ是肿瘤化疗过程中重要的靶酶，高表达对化疗药物敏感，低表达使细胞毒性降低，甚至耐药。本实验结果显示，P-gp、GST-π、TopoⅡ、TS蛋白阳性表达率分别为57.14%（20/35）、51.43%（18/35）、71.43%（25/35）、57.14%（20/35）。由此可见宫颈癌组织在未接受化疗前已产生耐药蛋白，说明宫颈癌组织本身存在一种或多种耐药机制。本研究对象对TopoⅡ介导的原发耐药相对偏低，统计分析发现，P-gp、TopoⅡ蛋白表达与宫颈鳞状细胞癌对DDP、DDP+5-FU耐药无关（P＞0.05）。

GST-π主要功能为保护氧化剂对巯基的氧化，保护细胞膜中含巯基的蛋白质和酶不被破坏。目前越来越多的证据支持，GST-π在多种肿瘤中过表达，如非小细胞肺癌、乳腺癌、胃癌、结肠癌、卵巢癌等。研究发现[18]谷胱甘肽对DDP有解毒功能，也是使其耐药的原因之一。本实验分析发现GST-π蛋白高表达与宫颈癌DDP耐药有关。因此推断GST-π蛋白表达可能是导致宫颈癌对DDP耐药的重要原因。TS是DNA合成所必需的酶，5-FU是通过对TS蛋白的抑制而发挥其抗癌活性。研究发现[19]，TS的高表达与氟尿嘧啶耐药有关，5氟尿嘧啶就是通过对TS蛋白的抑制而发挥其抗癌活性。Oguri等[20]研究发现，TS和细胞内代谢酶的表达与5-FU的敏感性和（或）耐药性有关。本研究结果也显示，TS蛋白的表达与DDP+5-FU的耐药有关。因此推断，TS蛋白高表达可能是导致宫颈癌对DDP+5-FU耐药的重要原因。

综上所述，中晚期宫颈癌同步放化疗中常用的两组化疗方案DDP及DDP+5-FU的ATP-TCA法体外有效率无显著差异。研究组还将继续进行体内的研究及大样本的临床病例的回顾性及前瞻性对比观察。GST-π、TS耐药蛋白阳性表达可用于临床宫颈鳞状细胞癌患者对DDP、5-FU化疗耐药的预测指标，从而避免盲目用药，造成医疗资源浪费及产生不必要的化疗不良反应。