鞣花酸对皮肤基底细胞癌A431和HSC-2细胞增殖、凋亡、侵袭能力的影响

王丹，王悦欣，汪熠，李连保

1昆明医科大学附属甘美医院/昆明市第一人民医院生物医学实验中心，昆明 650000

2昆明医科大学第一附属医院胃肠外科，昆明 650000

基底细胞癌又称基底细胞上皮瘤，具有较大的破坏性，其发病与日光照晒有密切关系，多见于老年人，好发于面部较突出的部位，目前学者们普遍认为它是来自表皮多潜能细胞的肿瘤。鞣花酸是一种多酚二内酯，是没食子酸的二聚体衍生物，广泛存在于各种软果、坚果等植物组织中。鞣花酸具有多种生物活性功能，如抗氧化、抗肝毒性、抗脂肪变性、抗胆汁淤积、抗纤维化、抗肝癌和抗病毒，可改善肝脏结构和病理状态[1]。鞣花酸通过核因子红细胞2相关因子2的转录激活增加抗氧化反应，并具有清除多种活性氧物质的活性。鞣花酸的应用有效地降低了循环中的脂质水平，防止了脂质过氧化[2-3]。段婧和黄卫东[4]认为鞣花酸具有广泛的抗肿瘤活性。有研究发现，鞣花酸可明显抑制雌激素诱导的乳腺癌细胞MCF-7的增殖，并抑制p-胞外信号调节激酶（extracellular signal-regulated kinase，ERK）1/2的表达，且呈剂量依赖性[5-6]。另有研究表明，鞣花酸能够明显抑制4T1细胞增殖并诱导其凋亡，还可明显提高荷瘤小鼠的特异性抗肿瘤免疫反应[7]。多种植物化学物质已被广泛用于应对生物系统中的各种氧化应激。鞣花酸是广泛研究的酚类抗氧化剂之一，已用于抵抗由不同化学物质或应激物诱导的氧化应激[4-5]。本研究以表皮癌细胞系A431和皮肤鳞状细胞癌细胞HSC-2为研究对象，观察鞣花酸对其增殖、凋亡、侵袭能力的影响，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 细胞、试剂及仪器

表皮癌细胞系A431和皮肤鳞状细胞癌细胞HSC-2均购自武汉普诺赛生命科技有限公司。鞣花酸购自美国Sigma公司，DMEM高糖培养基、青链霉素、胎牛血清和胰蛋白酶均购自美国Gibco公司，Transwell小室购自美国Corning公司，噻唑蓝（methylthiazolyldiphenyl- tetrazolium bromide，MTT）试剂、吉姆萨染色试剂盒均购自北京索莱宝科技有限公司，膜连蛋白Ⅴ（AnnexinⅤ）-异硫氰酸荧光素（fluorescein isothiocyanate，FITC）/碘化丙啶（propidium iodide，PI）细胞凋亡检测试剂盒购自美国ThermoFisher Scientific公司，Matrigel胶购自美国Beckman公司。多功能酶标仪购自美国Bio-Rad公司，倒置光学显微镜购自日本Olympus公司，流式细胞仪购自美国Beckman公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养及药物干预 使用含10%胎牛血清和1%青链霉素的DMEM高糖培养基培养A431和HSC-2细胞，使其贴壁生长，置于37℃、5% CO2的细胞培养箱中。本研究选择10 μg/ml的鞣花酸干预A431和HSC-2对数期细胞。

1.2.2 MTT 检测细胞增殖 为评估细胞增殖情况，将对数期细胞以每孔1×104个接种于96孔平板中，加入200 μl新鲜培养基和20 μl MTT溶液，然后37 ℃温育4 h。除去孔中的培养基和MTT溶液，加入二甲基亚砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）溶液。分别在0、3、6、12、24、48 h时测量595 nm处的吸光度（optical density，OD）。抑制率=[1-（实验组OD值-空白组OD值）（/对照组OD值-空白组OD值）]×100%。

1.2.3 流式细胞术检测细胞凋亡 将单细胞悬液用预冷的磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline，PBS）洗2次，然后加入1×结合缓冲液1 ml重悬细胞。取 100 μl加入到 5 ml的培养管中，加入 5 μl FITC标记的AnnexinⅤ和5 μl PI，混匀后室温下避光孵育15 min，然后再加入400 μl的1×结合缓冲液。整个操作过程动作要尽量轻柔，勿用力吹打细胞。反应完毕后尽快在1 h内上机检测，用FL1通道检测FITC-AnnexinⅤ荧光，FL2通道检测PI荧光。同时以不加FITC-AnnexinⅤ及PI的样本管作为阴性对照。结果判断：中晚期凋亡细胞和坏死细胞的细胞膜有损伤，PI能够穿透细胞膜而使DNA被PI染色产生红色荧光。而细胞膜保持完好的早期凋亡细胞对PI有抗染性，不会产生红色荧光，正常活细胞与之相似。在双变量流式细胞仪的散点图上，左下象限（FITC-/PI-）显示活细胞，右下象限（FITC+/PI-）为早期凋亡细胞，右上象限（FITC+/PI+）为晚期凋亡细胞。

1.2.4 Transwell小室实验检测细胞侵袭 将细胞用无血清培养基重悬，并在铺有基底膜基质胶的Transwell上室中接种，下室中加入含10%胎牛血清的DMEM培养基。24 h后，用棉签刮下上室细胞，采用4%多聚甲醛固定下室细胞，用吉姆萨染色试剂染色。将小室翻转后置于倒置显微镜下进行细胞计数。实验重复3次。

1.3 统计学分析

采用Graphpad 5.0软件对数据进行统计分析，计量资料以均数±标准差（±s）表示，组间比较采用t检验，重复测量数据的比较采用单因素方差分析，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 鞣花酸干预对A431和HSC-2细胞增殖的影响

MTT检测结果显示，与干预前（0 h）比较，鞣花酸干预6、12、24、48 h后，其对A431和HSC-2细胞的抑制率均升高，差异均有统计学意义（P＜0.05）。随着鞣花酸作用时间的延长，A431和HSC-2细胞抑制率均逐渐增加，但当作用时间超过24 h后，抑制率无明显变化。因此，后续实验采用24 h为干预时间。（表1）

表1 鞣花酸干预前和干预后不同时间点A431和HSC-2细胞抑制率的比较（%，±s）

表1 鞣花酸干预前和干预后不同时间点A431和HSC-2细胞抑制率的比较（%，±s）

注：*与同细胞0 h比较，P＜0.05

细胞A 4 3 1 H S C-2 0 0 4.0 1±0.5 8*2.3 3±0.3 3 1 1.6 7±0.8 0*7.7 7±0.5 5*2 1.8 0±0.4 2*1 5.6 1±0.5 5*2 8.4 8±0.4 6*2 1.4 7±1.0 2*2 8.6 7±0.8 2*2 0.7 0±0.8 4*0 h 3 h 6 h 1 2 h 2 4 h 4 8 h

2.2 鞣花酸干预对A431和HSC-2细胞凋亡的影响

细胞凋亡检测结果表明，鞣花酸干预后A431活细胞比例为（63.21±4.35）%，明显低于干预前的（90.37±2.35）%，差异有统计学意义（t=41.223，P＜0.01）。鞣花酸干预后HSC-2活细胞比例为（79.21±2.32）%，低于干预前的（85.37±1.55）%，差异有统计学意义（t=29.557，P＜0.05）。（图1）

图1 流式细胞术检测鞣花酸干预前后A431和HSC-2细胞凋亡

2.3 鞣花酸干预对A431和HSC-2细胞侵袭能力的影响

鞣花酸干预后A431侵袭细胞个数为（23.26±7.23）/HP，明显低于干预前的（58.24±4.23）/HP，差异有统计学意义（t=15.324，P＜0.01）。鞣花酸干预后HSC-2侵袭细胞个数为（22.56±2.23）/HP，明显低于干预前的（48.44±3.13）/HP，差异有统计学意义（t=27.881，P＜0.01）。（图2）

3 讨论

鞣花酸是一种天然酚类抗氧化剂，存在于众多水果和蔬菜中。鞣花酸是没食子酸的二聚体衍生物，很少在饮食作物中自由存在，但通常发生在与糖苷部分（葡萄糖、木糖）结合的食品中或形成鞣花单宁的一部分。这些化合物通常出现在水果（如石榴、柿子、覆盆子、黑莓、草莓、桃子）、坚果（如核桃、杏仁）、蔬菜和葡萄酒中[8-10]。有研究表明，鞣花酸具有与没食子酸、咖啡酸、原儿茶酸、表儿茶素和山奈酚相似的抗氧化活性，但活性高于阿魏酸[11-13]。鞣花酸具有抗增殖和抗氧化特性，是一种非常有前途的治疗慢性疾病的药物，尤其是溃疡性结肠炎、阿尔茨海默病和糖尿病[14-17]。鞣花酸的抗糖尿病潜力使其成为传统降糖药物的潜在替代品，也是糖尿病药物研究的有力候选者[18]。鞣花酸也具有保肝和抗癌特性。然而，在应用于人类疾病的治疗前，需要进行详细的毒性评估，验证其安全性和有效性。

图2 Transwell 小室实验检测鞣花酸干预前后A431和HSC-2细胞侵袭能力（吉姆萨染色，×20）

基底细胞癌是皮肤癌最常见的类型之一，也被称为基底细胞上皮瘤、基底细胞样细胞瘤浸润性溃疡等。基底细胞癌是由未成熟、非间变的类似基底细胞构成的局部破坏性癌。1902年Krompecher将其与其他上皮性肿瘤进行了明确的区分，其特征是发展缓慢，呈现浸润性生长，但血液或淋巴结转移少，恶性程度低[19-20]。基底细胞癌多发生在头部、面部，开始呈现较硬的斑状丘疹或呈疣状突起，逐渐形成溃疡。早期手术切除是合适的治疗方法，骨浸润时必须辅助全身化疗。

本研究的MTT实验表明，鞣花酸可以抑制A431和HSC-2细胞增殖，24 h为最佳抑制时间。流式细胞仪检测结果显示，鞣花酸对A431和HSC-2细胞具有促凋亡作用。Transwell小室实验表明，鞣花酸可以在一定程度上抑制A431和HSC-2细胞的侵袭能力。

综上所述，鞣花酸不仅能够抑制A431和HSC-2细胞增殖，诱导其凋亡，还能够抑制其侵袭，有望成为治疗皮肤基底细胞癌的新药物，为临床治疗皮肤基底细胞癌提供了新思路。