端粒酶相关蛋白1在宫颈鳞状上皮病变中的表达*

陈 娟，冯俊明，李明松，雷 雪，黄 鄂

(重庆市璧山区人民医院病理科 402760)

端粒酶是一种具有反转录酶活性的核糖核蛋白，由人端粒酶RNA组分(human telomeric RNA component，hTERC)、人端粒酶反转录酶(human telomeric reverse transcriptase，hTERT)及端粒酶相关蛋白 (telomeraseassociated protein，TP)3部分亚基构成[1-2]。该三组分可调节端粒酶活性，其中任一组分发生改变便会影响端粒酶活性[2-3]。研究证明，在正常人体组织中端粒酶活性受到抑制，在恶性肿瘤中却被激活。而端粒酶的活化直接影响细胞的分裂、增殖，端粒酶活性的增强可使细胞获得无限增殖能力，最终导致细胞的病变，乃至癌变[3-4]。现已有文献报道，端粒酶活性的增强会加快肺癌[5-6]、脑胶质母细胞瘤[7-9]及胰腺癌[10]的发展，并提示一个不理想的预后。

宫颈癌是常见的妇科恶性肿瘤之一，现已有文献报道宫颈癌的发生、发展与hTERC及hTERT的激活呈正相关，宫颈鳞状上皮内病变级别越高，其活性越强[11-12]。而端粒酶相关蛋白(TP1)在宫颈鳞状上皮病变的作用尚少见相关研究。本研究旨在探索TP1在不同级别宫颈鳞状上皮病变中(慢性宫颈炎、低级别鳞状上皮内病变及高级别鳞状上皮内病变)的表达情况及其与端粒酶活性的关系，探讨其在宫颈鳞状上皮病变中的可能作用及临床意义。

1 资料与方法

1.1 一般资料

采用回顾性研究的方法，收集2019年1-12月在本院行宫颈活检的100例女性患者为研究对象，年龄22～77岁，平均(43.26±10.09)岁。以组织病理检查结果为标准将其分为3组：慢性宫颈炎组29例、低级别鳞状上皮内病变组34例、高级别鳞状上皮内病变组37例，对3组患者的组织活检标本进行TP1免疫组织化学染色及端粒酶活性检测。纳入标准：在本院已行宫颈组织活检，且活检组织标本最大径≥2 mm；排除标准：宫颈活检组织标本最大径<2 mm或富含大量黏液的活检标本。本研究经本院伦理委员会审核并通过(2019-KY-07)。

1.2 方法

1.2.1TP1免疫组织化学染色

TP1免疫组织化学试剂一抗购自美国Santa Cruz公司，浓度为1.0 mg/μL，无核水稀释到10 ng/μL，采用SP免疫组织化学染色法，通用型二抗购自福州迈新生物技术开发有限公司。操作步骤严格按说明书执行。结果判读：TP1阳性表达于核浆，棕色颗粒状。无阳性细胞判为-，阳性细胞数≤25%判为+，阳性细胞数>25%～50%判为++，阳性细胞数>50%阳性为+++。细胞阳性率=20个高倍镜下(400倍)阳性细胞数/20个高倍镜下细胞总数×100%。

1.2.2端粒酶活性检测

端粒重复序列扩增-ELISA(TRAP-PCR-ELISA)检测3组标本中端粒酶活性，试剂盒购自美国Bochringer mannheim公司，按说明书操作。测定波长450 nm(A450)和630 nm(A630)处吸光度值，吸光度差值(△A)=A450-A630,△A值代表细胞端粒酶活性。阳性对照由试剂盒提供，阴性对照为端粒酶提取物加1 mg/L RNaseA，37 ℃孵育20 min。

1.3 统计学处理

2 结 果

2.1 TP1在宫颈鳞状上皮病变中的阳性率比较

不同组别宫颈鳞状上皮病变的TP1阳性率比较，差异有统计学意义(χ2=30.328，P<0.001)；两两比较显示，低级别鳞状上皮内病变组及高级别鳞状上皮内病变组TP1阳性率均高于慢性宫颈炎组，差异有统计学意义(χ2=10.343,P校正=0.002；χ2=34.545，P校正<0.001)；低级别鳞状上皮内病变组与高级别鳞状上皮内病变组TP1阳性率比较，差异无统计学意义(χ2=4.870，P校正=0.085),见表1。

表1 TP1在宫颈鳞状上皮病变不同组别中的表达情况

2.2 TP1与宫颈鳞状上皮病变级别的相关性

慢性宫颈炎组TP1-，低级别鳞状上皮内病变组TP1+，高级别鳞状上皮内病变组TP1++～+++。TP1的表达与宫颈鳞状上皮病变级别呈正相关(Kendall′s tau-b=0.773，P<0.001)，随着宫颈鳞状上皮病变级别的增高，TP1表达增强，见图1。

A：慢性宫颈炎组(-)；B：低级别鳞状上皮内病变组(+)；C：高级别鳞状上皮内病变组(++～+++)。

2.3 端粒酶活性检测结果

端粒酶活性在阳性对照为1.37±0.04，阴性对照为0.06±0.01，在慢性宫颈炎组(0.36±0.04)、低级别鳞状上皮内病变组(1.02±0.07)及高级别鳞状上皮内病变组(1.75±0.05)逐渐增强，差异有统计学意义(F=10.863，P<0.05)。

2.4 TP1的表达强度与端粒酶活性的相关性

TP1表达-、+、++、+++对应的端粒酶活性分别为0.12±0.03、0.90±0.03、1.36±0.04、1.79±0.12，差异有统计学意义(H=10.992，P=0.028)，TP1表达强度增强对应的端粒酶活性逐渐增强。

3 讨 论

宫颈癌是妇科常见恶性肿瘤，发病主要与高危型人乳头瘤病毒(HPV)持续感染有关，目前通过宫颈癌筛查基本可以做到早发现、早诊断、早治疗。虽然现在临床上已有宫颈癌疫苗，但仍有少部分HPV高危型感染患者病情发展迅速，或发现时已经到了宫颈癌晚期，其原因目前尚不清楚。有文献报道，端粒酶hTERC及hTERT两组分被激活，使端粒酶活性增加，从而进一步增强高危型HPV在宫颈病变中的致瘤作用[13]，其可能机制为端粒酶活性增加，参与调节酪氨酸蛋白酶信号传递，激活HPVE6/E7癌基因，有助于在潜伏期将HPVE6/E7癌基因整合到宿主端粒中，并能有效抑制抑癌基因P53及视网膜母细胞瘤(RB)肿瘤抑制蛋白的活性，细胞周期失去调控从而抑制细胞凋亡，使高危型HPV病毒能在宿主中持续存活，从而导致宫颈鳞状上皮病变[14]，进一步加快癌变过程。

端粒酶协同蛋白TP1作为端粒酶三组分之一，在肿瘤细胞形成过程中的作用尚缺乏文献报道。赵瑞皎等[15]发现，TP1在卵巢恶性浆液性上皮性肿瘤中的表达强于良性浆液性上皮性肿瘤，而与端粒酶活性无相关性，提示TP1可能通过某未知的途径促进了肿瘤的发展。而在KATZENELLENBOGEN[16]的研究中发现，HPVE6可以通过多重机制使端粒酶活性增加，如通过抑制Maz及锌指转录因子Sp1的活性，从而使TP1表达上调，加快了宫颈鳞状上皮病变的进一步发展。在本研究中，低级别鳞状上皮内病变组及高级别鳞状上皮内病变组TP1阳性率均明显高于慢性宫颈炎组，而低级别鳞状上皮内病变组及高级别鳞状上皮内病变组TP1阳性率无明显差异，同样提示TP1可能通过某种途径参与了HPV的感染途径，而主要可能在HPV持续感染、DNA整合过程起着重要的作用[14]。TP1的表达与宫颈鳞状上皮病变级别呈正相关，随着宫颈鳞状上皮病变级别的增高而表达增强，提示TP1在宫颈鳞状上皮癌变过程中起着促进作用。

在本研究中发现，端粒酶活性信号在慢性宫颈炎组、低级别鳞状上皮内病变组及高级别鳞状上皮内病变组是逐渐增强的，并且TP1的表达与端粒酶活性呈正相关，提示TP1高表达可能增强了端粒酶的活性，从而促进或加快了宫颈鳞状上皮病变进一步发展，异型增生，乃至癌变。

综上所述，TP1随着宫颈鳞状上皮病变级别的增高而表达上调，且与端粒酶活性存在正相关性，提示TP1高表达可能增强了端粒酶的活性，从而促进宫颈鳞状上皮病变进一步发展，甚至永生化、癌变，但TP1可否作为宫颈鳞状上皮病变判断级别及预后的一个指标还需进一步探索和实验证明。