白细胞介素-8沉默对喉鳞状细胞癌细胞增殖和凋亡的影响及机制研究

张潜英，唐正琪，郝成罗，岳显，马丽梅，陈鸿雁

自贡市第三人民医院1耳鼻咽喉头颈外科，2肿瘤科，3病理科，四川 自贡 643020

4重庆医科大学附属第一医院耳鼻咽喉头颈外科，重庆 400016

白细胞介素-8（interleukin-8，IL-8）是最早发现的趋化因子，可在促进中性粒细胞趋化和脱粒中发挥重要作用[1-3]。研究显示，IL-8可以激活G蛋白偶联受体[包括CXC趋化因子受体1（C-X-C chemokine receptor 1，CXCR1）和CXC趋化因子受体2（C-X-C chemokine receptor 2，CXCR2）]下游的多种细胞内信号通路[4-5]。研究显示，IL-8及其受体在多种肿瘤细胞、内皮细胞、浸润性中性粒细胞和肿瘤相关的巨噬细胞中表达均上调[6-9]，表明IL-8可能在肿瘤微环境中发挥关键调控因子的作用。既往研究表明，IL-8表达上调与肿瘤形成、进展及血管形成密切相关[4]。研究表明，IL-8在肿瘤血管生成中发挥重要作用，可促进肺癌及胃癌细胞的侵袭和转移过程[2,4,8-9]；IL-8也可以通过调控基质金属蛋白酶2（matrix metalloproteinase 2，MMP2）和基质金属蛋白酶9（matrix metalloproteinase 9，MMP9）的表达促进肿瘤细胞增殖、迁移和淋巴结转移[3,5,7]。目前，研究者已对IL-8在多种恶性肿瘤中的作用进行了研究，但其在喉鳞状细胞癌中的研究仍然较少。

喉鳞状细胞癌是头颈部肿瘤中恶性程度最高的肿瘤之一[10-12]，虽然发病率和病死率逐年降低，但其现状仍不乐观[13]。数据显示，2013年美国喉鳞状细胞癌新发12 260例，病死3630例[14]。虽然喉鳞状细胞癌的发病率和病死率较低，但咳嗽、呼吸困难和吞咽困难等由其引起的并发症可导致患者预后较差，此外，临床对分化程度较高的喉鳞状细胞癌患者的诊断和治疗仍较困难[15-17]。本研究旨在探讨沉默IL-8的表达对喉鳞状细胞癌细胞增殖和凋亡的影响，以及对凋亡相关因子cleaved caspase 3、B细胞淋巴瘤/白血病-2（B cell lymphoma/leukemia-2，Bcl-2）、Bcl-2相关X蛋白（Bcl-2 associated X protein，BAX）表达的影响。另外，庞雪莉等[18]研究发现，IL-8可通过激活磷酸肌醇3-激酶（phosphatidylinositide 3-kinase，PI3K）/蛋白激酶 B（protein kinase B，PKB，又称AKT）信号通路进而抑制乳腺癌细胞的凋亡。因此，本研究进一步对IL-8的分子机制进行了研究，旨在为喉鳞状细胞癌的有效治疗奠定基础，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 细胞、主要试剂和仪器

人喉鳞状细胞癌Hep-2细胞系购自中国科学院上海细胞库。DMEM培养基购自美国Gibco公司，胎牛血清购自江苏四季青生物公司，IL-8小干扰RNA（small interfering RNA，siRNA）购自上海杰李生物技术有限公司，Lipofectamine 2000转染试剂购自美国Thermo Fisher公司，二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）蛋白定量试剂盒、蛋白裂解液均购自上海生工生物工程有限公司，IL-8抗体购自美国Abcam公司，AKT、磷酸化AKT（phosphorylated-AKT，p-AKT）、cleaved caspase 3、Bcl-2、BAX、甘油醛-3-磷酸脱氢酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）抗体均购自美国CST公司，噻唑蓝（methylthiazolyl tetrazolium，MTT）试剂均购自美国Sigma公司，膜联蛋白Ⅴ（AnnexinⅤ）-异硫氰酸荧光素（fluorescein isothiocyanate，FITC）/碘化丙啶（propidium iodide，PI）凋亡检测试剂盒购自美国BD公司。

1.2 实验方法

1.2.1 细胞培养和分组 喉鳞状细胞癌Hep-2细胞系在含10%胎牛血清的DMEM培养基中培养。将IL-8siRNA和Lipofectamine 2000转染试剂转染至喉鳞状细胞癌Hep-2细胞作为实验组将仅加入Lipofectamine 2000转染试剂的喉鳞状细胞癌Hep-2细胞作为NC组，未做处理的细胞作为空白组。实验重复3次。

1.2.2 MTT法检测细胞增殖能力 取3组喉鳞状细胞癌Hep-2细胞接种于96孔板，培养48 h后向3组细胞中加入0.5 mg/ml的MTT溶液，培养箱中孵育4 h，弃去MTT溶液后，每孔加入150 μl的二甲基亚砜（dimethyl sulfoxide，DMSO），摇床振荡10 min，采用酶标仪490 nm波长处测定光密度（optical density，OD）值。实验重复3次。

1.2.3 流式细胞仪检测细胞凋亡情况 取3组喉鳞状细胞癌Hep-2细胞，采用预冷的PBS冲洗2次，采用的0.25%的胰蛋白酶消化50 s，立即采用细胞培养基中和胰蛋白酶。收集细胞至1.5 ml的离心管中，1000 r/min，4℃离心4 min，除去上清液，收集细胞后采用500 μl的1×结合缓冲液（binding buffer）重悬，每管取100 μl细胞悬液，加入5 μl FITCAnnexin Ⅴ孵育15 min，加入5 μl PI孵育15 min。室温孵育15 min，采用流式细胞仪检测3组细胞的凋亡情况。实验重复3次。

1.2.4 蛋白质印迹法（Western blot）检测8、AKT、p-AKT、cleaved caspase3、Bcl-2、BAX蛋白相对表达量 取3组喉鳞状细胞癌Hep-2细胞，采用预冷的PBS冲洗2次，接种于6孔板，每孔加入100 μl的蛋白裂解液（含蛋白酶及磷酸酶抑制剂），收集细胞至1.5ml离心管中，采用细胞超声破碎仪10%的功率破碎细胞。冰上放置5 min充分裂解后，12000 r/min，4℃离心20 min，提取上清液至新的离心管中，提取细胞中的总蛋白。采用BCA蛋白浓度检测试剂盒测定各蛋白的浓度，将蛋白样品配制成1×负载缓冲液（loading buffer），使用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecylsulfate-polyacrylamide gelelectrophoresis，SDSPAGE）分离蛋白样品，电泳结束后，利用湿转法将蛋白转移至聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PⅤDF）膜上，100Ⅴ恒压转移1.5 h，5%脱脂牛奶封闭2 h，磷酸盐吐温缓冲液（phosphate buffered solution toween，PBST）溶液冲洗3次。加入一抗4℃过夜孵育，PBST溶液洗膜，加入二抗，室温孵育1 h，PBST洗膜3次后，以电化学发光（electrochemiluminescence，ECL）法显影，在凝胶成像系统中曝光、拍照，采用Image J图像分析软件分析条带灰度值，以GAPDH作为内参，计算目的蛋白的相对表达量。

1.3 统计学方法

采用SPSS 20.0软件对所有数据进行统计分析。计量资料以均数±标准差（±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，多组间两两比较采用LSD-t检验，两组间比较采用t检验；以P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 细胞增殖能力的比较

实验组喉鳞状细胞癌Hep-2细胞中IL-8蛋白的相对表达量为（0.38±0.10），明显低于NC组细胞的（0.77±0.14）和空白组细胞的（0.72±0.12），差异均有统计学意义（t=6.412、6.156，P＜0.01）。实验组喉鳞状细胞癌Hep-2细胞的OD值为（0.64±0.09），明显低于NC组细胞的（0.98±0.10）和空白组细胞的（1.00±0.13），差异均有统计学意义（t=7.148、6.440，P＜0.01）。

2.2 细胞凋亡情况的比较

实验组喉鳞状细胞癌Hep-2细胞的凋亡率为（41.63±3.76）%，明显高于空白组细胞的（3.22±0.86）%和NC组细胞的（7.25±1.46）%，差异均有统计学意义（t=28.171、24.109，P＜0.01）。（图1）

图1 流式细胞仪检测3组喉鳞状细胞癌Hep-2细胞的凋亡情况

2.3 AKT、p-AKT、cleaved caspase3、Bcl-2、BAX蛋白相对表达量的比较

实验组Hep-2细胞中p-AKT和抑制凋亡蛋白Bcl-2的相对表达量均低于空白组和NC组细胞，而促凋亡蛋白BAX和cleaved caspase 3的相对表达量均高于空白组和NC组细胞，差异均有统计学意义（P＜0.05）。但3组Hep-2细胞AKT蛋白的相对表达量比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。（表1）。

表1 3组细胞IL-8、AKT、p-AKT、cleaved caspase 3、Bcl-2、BAX蛋白的相对表达量的比较（±s）

表1 3组细胞IL-8、AKT、p-AKT、cleaved caspase 3、Bcl-2、BAX蛋白的相对表达量的比较（±s）

注：a与NC组比较，P＜0.05；b与空白组比较，P＜0.05

蛋白A K T p-A K T c l e a v e d c a s p a s e 3 B c l-2 B A X实验组0.9 2±0.1 8 0.4 4±0.1 1 a b 0.5 1±0.1 3 a b 0.4 5±0.1 2 a b 0.3 7±0.0 8 a b N C组0.9 5±0.2 0 0.7 1±0.1 5 0.3 6±0.0 9 0.6 7±0.1 5 0.2 2±0.0 6空白组0.9 6±0.1 8 0.7 6±0.1 7 0.3 4±0.0 8 0.6 4±0.1 4 0.2 4±0.0 6

3 讨论

肿瘤细胞与癌旁细胞的相互作用，包括多种细胞因子介导的细胞间相互作用，在肿瘤进展中均发挥重要作用[2,5,7]。IL-8也被称为趋化因子配体8（C-X-C chemokine ligand 8，CXCL8），对中性粒细胞具有趋化作用，并可通过与相应的受体结合调控细胞生物学过程[3,7]。IL-8的受体包括CXCR1和CXCR2，这是一类跨膜的G蛋白偶联受体，其下游的多种细胞内信号通路在细胞存活、增殖和凋亡等生物进程中发挥关键作用[1,6,8]。多项研究表明，IL-8及其受体在多种肿瘤细胞、内皮细胞、浸润性中性粒细胞及肿瘤相关的巨噬细胞中表达上调[3,7,9]。肿瘤相关研究结果显示，IL-8对肿瘤新生血管生成、中性粒细胞向肿瘤位点募集和肿瘤细胞存活、增殖和转移均具有重要作用[2,8]。但目前对IL-8在喉鳞状细胞癌中作用的研究较少，其在喉鳞状细胞癌中的具体作用机制尚不明确。

喉鳞状细胞癌作为头颈部肿瘤中恶性程度最高的肿瘤之一[12,17]，尽管目前已有多种诊断和治疗手段应用于临床，但喉鳞状细胞癌患者的生存率一直较低[19-20]。这可能是因为临床针对喉鳞状细胞癌的发生发展及恶性进展机制尚未完全明确，导致临床对组织学分级较高的喉鳞状细胞癌患者的诊断和治疗较困难[21]。因此，本研究旨在探讨喉鳞状细胞癌的发生发展机制，为临床诊断和治疗提供新的靶点和策略。

本研究结果显示，IL-8siRNA可抑制喉鳞状细胞癌Hep-2细胞的增殖能力，采用流式细胞仪进一步检测细胞凋亡情况，结果显示，IL-8siRNA可促进喉鳞状细胞癌Hep-2的凋亡，表明IL-8可能在喉鳞状细胞癌Hep-2细胞增殖、凋亡等生物学过程中发挥关键作用。本研究通过检测PI3K/AKT信号通路的激活情况及凋亡相关蛋白的相对表达量，结果表明，IL-8可通过对PI3K/AKT相关信号通路的调控，抑制喉鳞状细胞癌Hep-2细胞的增殖能力，并促进其凋亡。

综上所述，IL-8可通过对PI3K/AKT相关信号通路的调控，抑制喉鳞状细胞癌Hep-2细胞的增殖能力，并促进其凋亡，为喉鳞状细胞癌的诊断和治疗提供了新的靶点及可能的治疗策略。