微滴式数字PCR定量分析新生儿的肠道菌群

边燕飞 孙天松 孙志宏

（内蒙古农业大学 乳品生物技术与工程教育部重点实验室农业部奶制品加工重点实验室 呼和浩特010018）

近年来，越来越多的研究表明新生儿出生时已携带大量细菌。2014年，Ardissone 等[1]利用多路复用测序技术发现新生儿胎便中存在多种细菌DNA，其中含有肠球菌属（Enterococcus）、葡萄球菌属（Staphylococcus）、乳杆菌属（Lactobacillus）和肠杆菌属（Enterobacter）。同年，郭贺[2]基于Illumina测序平台对足月新生儿胎便菌群进行分析，发现胎便细菌在门水平上主要隶属于变形菌门（Proteobacteria）和厚壁菌门（Firmicutes），其中相对含量最高的菌属包括拟杆菌属（Bacteroides）、双歧杆菌属（Bifidobacterium）、梭菌属（Clostridium）和链球菌属（Streptococcus）。这些研究表明新生儿的肠道菌群在母体子宫内就已经开始建立，而随后肠道菌群的发育和成熟是一个动态的非随机过程，在此过程中，肠道菌群间发生相互促进和抑制作用，并受到各种条件的影响，如分娩方式、分娩时间、喂养方式和抗生素使用情况等。

分娩方式是新生儿肠道菌群建立的一个重要影响因素。多数研究认为新生儿在自然分娩过程中会直接接触母体的阴道细菌，从而导致阴道相关微生物如乳杆菌属和普氏菌属（Prevotella）在新生儿肠道中定殖；相比之下，剖腹产是利用外科手术直接将胎儿从子宫内取出，失去了唯一能够接触产道的机会，更容易被来自母亲皮肤、医护人员或医院的环境微生物定殖[3-4]。然而，这些研究主要是利用测序方法分析分娩方式对新生儿肠道菌群结构的影响，仅能对新生儿肠道菌群进行定性分析，无法定量分析。此外，随着国家二胎政策的全面落实，以及晚婚晚育观念的深入人心，高龄孕产妇的比例在逐渐增加，有研究发现高龄产妇与胎儿早产、畸形和死亡风险的增加有关，可能对新生儿的健康具有长期影响[5]，然而产妇生育年龄对新生儿肠道菌群影响的研究却未见报道。微滴式数字PCR（droplet digital PCR，ddPCR）作为一种新型定量技术，其原理是利用微流体回路和表面活性剂将样本预混液进行微滴化处理，制成油包水的分散微滴后进行PCR 扩增反应，并利用微滴分析仪对微滴逐个检测，最终经软件计算出目标DNA 分子的浓度。此技术具有灵敏度高，精确度高以及耐受性好等优点，无需制备标准品即可直接获得靶分子的浓度或拷贝数，能够更加精确地对环境样品中的微生物进行绝对定量分析[6]。

本研究采用微滴式数字PCR 技术，以14 份新生儿胎便样品为研究对象，对样品中细菌总数和肠杆菌科（Enterobacteriaceae）、乳杆菌属、双歧杆菌属、拟杆菌属、梭菌属、普氏菌属、链球菌属、乳球菌属（Lactococcus）、肠球菌属以及大肠杆菌（Escherichia coli）这些核心菌群进行定量研究，旨在分析产妇的分娩方式和生育年龄对新生儿肠道菌群的影响。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 样品采集 本研究的14 份新生儿胎便样品均采自内蒙古医科大学附属医院，新生儿均为足月分娩，其中7 名新生儿为自然分娩，7 名新生儿为剖腹产分娩；3 名新生儿所对应产妇为高龄产妇（年龄≥35），11 名新生儿所对应产妇为适龄产妇，新生儿 体重（3.0～3.95 kg）和身高（46～55 cm）正常。所有胎便样品均采用常规和标准清洁技术在医院采集，采集后的样品立即以1∶1 的比例加入DNA 保护剂混匀，迅速低温保存并转移至实验室-80 ℃冰箱备用。

1.1.2 试剂 Qiagen 粪便DNA 快速提取试剂盒（QIAamp Fast DNA Stool Mini Kit），德国QIAGEN 公司；RNA/DNA 保护剂 （Sample Protector for RNA/DNA），大连宝生物技术有限公司；QX200染料法预混液 （QX200 ddPCR EvaGreen Supermix）、QX200 探针法预混液（ddPCR Supermix for Probes）、染料法微滴发生专用油（QX200 Droplet Generation Oil）、探针法微滴发生专用油（Droplet Generation Oil for Probes）、微滴分析专用油（Droplet Reader Oil），美国Bio-Rad 公司。

1.2 仪器与设备

5810R 台式高速冷冻离心机，德国Eppendorf公司；HWS24 型电热恒温水浴锅，上海一恒科技有限公司；ND-1000 型微量紫外分光光度计，美国Nano Drop 公司；微滴发生卡及密封垫、QX200 微滴发生器、96 孔板热封仪、96 孔温度梯度热循环仪、微滴分析仪，美国Bio-Rad 公司。

1.3 试验方法

1.3.1 胎便样品宏基因组DNA 的提取 取0.5 g胎便样品，利用QIAamp Fast DNA Stool Mini Kit 试剂盒提取样品中细菌宏基因组DNA，检验所提取DNA 的纯度和浓度，将符合后续试验要求的DNA 置于-20 ℃冰箱备用。

1.3.2 胎便样品核心菌群的定量研究

1） 将胎便样品DNA、引物探针（10 nmol/L）以及预混液混合均匀，具体反应体系见表1。

表1 ddPCR 反应体系Table 1 The ddPCR reaction system

2） 将含有样品DNA 的20 μL ddPCR 反应混合液和70 μL 微滴发生专用油转移至微滴生成卡的指定位置，转移时尽量轻柔，避免引入气泡，液体转移完毕后钩牢胶垫两边的小孔。将微滴生成卡放入微滴发生器内，每个样品将生成约20 000 个油包水的分散微滴，8 个样品大约需2 min。

3） 将上述生成的约40 μL 微滴转移至PCR反应板相应的孔内，用铝膜封闭PCR 板，在96 孔板热封仪内封膜，并在30 min 内进行PCR 扩增，扩增体系为：95 ℃10 min；95 ℃30 s，退火温度40 s，40 个循环；4 ℃5 min，90 ℃5 min（染料法）/98 ℃10 min（探针法），具体引物探针序列如表2所示。

4） 将反应结束后的PCR 板直接放入微滴分析仪内，设置样品信息后分析仪对每个微滴的荧光信号逐个检测、分析，QuantaSoftTM分析软件根据每个样品中阳性微滴/总微滴的数目计算出目标菌的浓度（拷贝数/μL），每个样品大约需1 min。

1.3.3 数据分析 计算胎便样品中目标菌的定量结果，细菌定量结果lg（拷贝数/g）表示为平均值±标准偏差，采用Mann-Whitney 检验计算不同分组新生儿肠道中细菌绝对含量的差异显著性，P＜0.05 被认为具有统计学意义，并应用GraphPad Prism 6 软件对胎便样品的细菌定量结果作图。

表2 目标菌特异性引物及扩增条件Table 2 Specific primers and amplification conditions of bacterial targets

2 结果与分析

2.1 不同分娩方式新生儿肠道核心菌群定量结果

图1 不同分娩方式婴儿肠道总菌的绝对含量Fig.1 Quantities of the total number of bacteria in meconium based on different delivery mode

本研究对14 名足月新生儿胎便中的细菌总数进行定量研究，发现所有新生儿胎便中均存在细菌，不同分娩方式新生儿胎便中的细菌总数定量结果如图1所示，自然分娩和剖腹产新生儿每克胎便中的16S rRNA 基因拷贝数取对数后分别为：5.49±0.20 和5.23±0.14，不同分娩方式新生儿肠道总菌的绝对含量存在显著差异，且自然分娩新生儿肠道总菌的含量显著高于剖腹产新生儿（P＜0.05）。2016年，Rocio 等[18]利用DAPI 染色法对143 名不同分娩方式新生儿胎便中的细菌进行计数，结果同样发现自然分娩婴儿胎便中的细菌总数显著高于剖腹产婴儿。Huurre 等[19]利用荧光原位杂交技术研究婴儿肠道微生物，结果发现1月龄自然分娩婴儿肠道细菌的细胞总数平均值为9.9×109细胞/g，而剖腹产婴儿肠道细菌的细胞总数平均值仅为3.1×109细胞/g，自然分娩婴儿肠道总菌的数量同样显著高于剖腹产婴儿；此外还发现自然分娩婴儿外周血中的免疫球蛋白IgA、IgG和IgM 分泌细胞总数显著低于剖腹产婴儿，而这种抗体分泌细胞总数的差异可能是由于抗原过度暴露于脆弱的肠道中导致。事实上，共生菌与肠上皮组织相互作用形成黏膜屏障，在保护肠道免受损伤方面起主要作用。在正常平衡状态下，共生菌和病原体被特异性toll 样受体识别，并且共生菌和病原体在随后的非炎症和炎症免疫反应之间存在差异。如果这种平衡被打破，那么肠上皮细胞可能以更快的速度增殖，使肠道防御屏障容易受到抗原的侵袭，这种抗原早期主要来源于食物和细菌[20]。因此，不同分娩方式可能通过影响婴儿肠道菌群的发育，从而对婴儿免疫功能产生影响。

为进一步具体分析是哪种细菌使得不同分娩方式新生儿肠道菌群含量的显著差异，本试验利用染料法对肠道核心菌群肠杆菌科、乳杆菌属、双歧杆菌属、拟杆菌属、梭菌属、普氏菌属、链球菌属、乳球菌属、肠球菌属进行定量研究。此外，鉴于在新生儿期，定殖在肠道中的大肠杆菌是新生儿感染的主要来源，因此本研究还利用探针法对大肠杆菌进行了定量研究。

通过对不同分娩方式新生儿肠道核心菌群的定量研究发现，肠杆菌科和乳杆菌属在不同分娩方式新生儿胎便样品中的绝对含量存在显著性差异，而其它核心菌群的含量则无明显差异，具体结果如图2所示，肠杆菌科在自然分娩和剖腹产新生儿每克胎便中的基因拷贝数取对数后分别为：3.51±0.22 和3.26±0.17，自然分娩新生儿肠道肠杆菌科的含量显著高于剖腹产新生儿（P＜0.05）。肠杆菌科作为成人典型的粪便细菌，新生儿胎便中存在的肠杆菌科常被认为是在分娩过程中受到母亲粪便的偶然污染导致。2013年，Kabeerdoss 等[21]利用qPCR 技术对不同分娩方式新生儿肠道肠杆菌科进行定量分析，发现与自然分娩新生儿相比，剖腹产新生儿肠道中肠杆菌科的丰度较低，与本研究结果一致。因此自然分娩新生儿胎便中高含量的肠杆菌科应该不仅仅是由于偶然的粪便污染导致，而可能是受母亲分娩方式的影响所致。

此外，乳杆菌属在自然分娩和剖腹产新生儿每克胎便中的基因拷贝数取对数后分别为：3.76±0.46 和3.34±0.11，自然分娩新生儿肠道乳杆菌属的绝对含量显著高于剖腹产新生儿（P＜0.05）。目前已有大量研究报道显示，乳杆菌属是人体健康阴道微生物的主要组成部分，能够产生大量乳酸为阴道提供一个酸性的环境，从而抑制病原菌的增殖或直接起到杀菌的作用，同时乳杆菌属产生的过氧化氢可以抑制各种微生物的生长，维持阴道微生态系统的平衡[22]。2017年，席晓霞[23]通过单分子实时测序技术对不同分娩方式新生儿胎便微生物进行研究后，发现自然分娩新生儿胎便样品中的乳杆菌种类高达17 种，而剖腹产新生儿胎便中的乳杆菌种类仅有8 种，其中阴道的优势菌种卷曲乳杆菌在自然分娩新生儿胎便中的平均相对含量和检出率均明显高于剖腹产新生儿，而惰性乳杆菌和阴道乳杆菌在剖腹产新生儿胎便中未被检出。2016年，Nagpal 等[24]利用RT-qPCR 技术同样发现自然分娩新生儿肠道乳杆菌属的定殖显著高于剖腹产新生儿。更有研究发现这种显著性差异即使在新生儿12 周龄时仍然存在[19]。因此，在自然分娩过程中，乳杆菌属能够由母亲传递给新生儿，而且分娩方式影响了母婴菌群的传递。

2.2 不同生育年龄产妇所生新生儿肠道菌群的定量研究

不同生育年龄产妇所生新生儿胎便中的细菌定量结果如图3所示：适龄产妇和高龄产妇所生新生儿每克胎便中的16S rRNA 基因拷贝数取对数后分别为5.40±0.22 和5.25±0.15。其它肠道核心菌群的定量结果如下：肠杆菌科为3.40 ±0.26 和3.45 ± 0.22；乳杆菌属为：3.59 ± 0.42 和3.40 ± 0.08；双歧杆菌属为：3.74 ± 0.42 和3.73 ±0.38；拟杆菌属为：3.73±0.42 和3.73±0.38；梭菌属为：2.93±1.03 和3.54±0.93；普氏菌属为：4.09±0.44 和4.81 ± 0.73；链球菌属为：2.57 ± 0.89和3.15 ± 0.49；乳球菌属为：3.74 ± 0.25 和3.94± 0.19；肠球菌属为：1.75±1.40 和1.49±2.58；大肠杆菌为：3.17±0.25 和3.23±0.32。

图2 不同分娩方式新生儿肠道菌群的绝对含量Fig.2 Quantities of gut microbiota of infants based on different delivery mode

图3 不同生育年龄产妇所生新生儿肠道菌群的绝对含量Fig.3 Quantities of intestinal microbiota of infants based on different childbearing age

通过差异性检验分析，发现链球菌属在高龄产妇所生新生儿肠道中的绝对含量显著高于适龄产妇所生新生儿（P＜0.05），而其它菌群的含量则无明显差异。据报道，有流产史、生育年龄高等因素可导致孕产妇感染B 族链球菌的几率增加，而B 族链球菌是围产期严重感染性疾病的主要致病菌之一，可造成母婴不良后果[25]。因此，母亲不同生育年龄可能影响新生儿肠道链球菌属的传递，而链球菌属的增多是否与新生儿感染性疾病的发生有关需要进一步研究。

3 讨论

本研究中不同分娩方式新生儿胎便样品的核心菌群除肠杆菌科和乳杆菌属以外其它菌属均不存在显著性差异，而Kuang 等[26]研究发现自然分娩新生儿胎便中的拟杆菌属含量显著高于剖腹产婴儿，与本研究结果不一致。这一差异可能是由于所研究新生儿的性别不同，目前已有研究发现婴儿肠道菌群的建立与性别相关，男性婴儿胎便中的细菌总数显著高于女性婴儿[18]，另一项有关成年人性别对肠道菌群影响的研究也发现男性肠道中拟杆菌属的定殖高于女性[27]，而本研究未采集新生儿的性别信息。此外，其它多项研究发现不同分娩方式婴儿出生数天后粪便中的双歧杆菌属、普氏菌属、梭菌属和链球菌属等存在差异[26，28-29]，这些差异可能受到婴儿喂养方式的影响，一般情况下，母亲在接受剖腹产手术后，很难对其婴儿进行母乳喂养，因此，剖腹产婴儿不能接受母乳喂养或者接受母乳喂养的时间比自然分娩婴儿晚。多数研究只针对分娩方式或者喂养方式单一因素对婴儿肠道菌群进行分析，Rocio 等[18]针对这一问题结合分娩方式和喂养方式两种因素对婴儿肠道菌群进行定量研究，发现自然分娩和母乳喂养有利于婴儿肠道中加氏乳杆菌 （Lactobacillus gasseri）和两歧双歧杆菌 （Bifidobacterium bifidum） 的定殖，剖腹产分娩和配方奶粉喂养有利于罗伊氏乳杆菌（Lactobacillus reuteri）的定殖，而罗伊氏乳杆菌在剖腹产分娩和母乳喂养婴儿肠道中并不多见，因此婴儿肠道罗伊氏乳杆菌、加氏乳杆菌和两歧双歧杆菌的存在受分娩方式和喂养方式的共同影响。除了分娩方式、喂养方式以外，其它影响婴儿早期肠道菌群建立的因素还包括：抗生素的使用、出生的地理位置、家庭成员以及母亲健康状况等。据报道，接受抗生素治疗后，婴儿肠道细菌总数降低，其中双歧杆菌属和葡萄球菌属的定殖减少，而且家庭成员中有兄姐的婴儿早期肠道微生物多样性和丰度会增加，其中链状双歧杆菌（Bifidobacterium catenulatum）的含量是头胎婴儿的9 倍多[18]。此外患有妊娠期2 型糖尿病的产妇所生婴儿富集与患病产妇相同的粪便微生物菌群，而且胎便中微生物的α 多样性，拟杆菌门（Bacteroidetes）和副拟杆菌属（Parabacteroides）的相对含量高于健康产妇所生婴儿[30]。Gosalbes 等[31]同样发现胎便中检测到的细菌类型受孕产妇健康状况的影响，而且可能对婴儿健康产生影响。胎便菌群结构能够在一定程度上反映孕产妇的健康状况，也与成长期婴幼儿的健康水平密切相关，因此，深入探索这部分菌群的结构和功能或可为新生儿疾病的预防及治疗带来全新视角。

本研究对14 名新生儿进行重新分组后，发现共有11 名新生儿其母亲属于适龄产妇，3 名婴儿其母亲属于高龄产妇，将所定量的菌属含量进行差异性检验分析后发现，高龄产妇所生新生儿肠道中链球菌属的绝对含量显著高于适龄产妇所生新生儿，而在本研究中新生儿胎便中链球菌属的含量不受分娩方式的影响。因此，产妇不同生育年龄可能影响新生儿肠道链球菌属的传递。当然考虑到本研究适龄产妇与高龄产妇所生新生儿的数量差别较大，这一发现仍需要在两组婴儿数量相当的研究中被证实，且今后婴儿肠道菌群建立的相关研究中母亲的生育年龄也应该作为被考虑的因素之一。

4 结论

本研究在14 份新生儿胎便样品中均检测到细菌，不同分娩方式新生儿肠道细菌总数存在显著差异（P＜0.05），其中自然分娩新生儿肠道中肠杆菌科以及乳杆菌属的绝对含量均显著高于剖腹产新生儿（P＜0.05）；而高龄产妇所生新生儿肠道中链球菌属的绝对含量显著高于适龄产妇所生新生儿，表明产妇的分娩方式和生育年龄可能影响母婴菌群的传递。同时，本研究所采用的微滴式数字PCR 技术具有高灵敏度的优点，可用于新生儿肠道菌群的定量检测。