松露的体外抗氧化性评价及对秀丽线虫的体内抗氧化

呼鑫荣 饶 欢 熊海宽 薛文通*

（1 北京食品营养与人类健康高精尖创新中心 中国农业大学食品科学与营养工程学院 北京100083 2 永仁野森达菌业有限公司 云南永仁651400）

松露是目前世界上最贵的食用菌菇之一，具有很好的经济价值。松露独特的土腥风味和口感质地[1]，使其广受消费者的欢迎。除风味独特外，松露还具有良好的营养价值和生物活性。松露富含蛋白质、维生素、矿物质等元素[1]，含有8 种人体必需氨基酸，是优质蛋白质良好的植物来源。研究表明，松露具有抗氧化性、抗肿瘤、抗炎、保肝护肝等多种生理活性[3]。人体内时刻都在发生氧化-还原反应，有氧呼吸过程中大约5%的氧会转化成活性氧和自由基[4]，细胞在新陈代谢过程中也会产生一系列的活性氧[5]，而过量自由基造成的氧化损伤是肿瘤、衰老等多种退行性疾病的主要原因之一[6]。人们开始越来越多地关注具有良好抗氧化活性的天然产物，而松露就是一种含有多种抗氧化物质的健康食材。研究发现，松露中的PST-W 多糖对DPPH 的清除率高达90.2%，对过氧化氢（300 mmol/L） 诱导的PC12 细胞损伤也有良好的抑制力，且多糖纯化程度越高，抗氧化能力就越强[7]。本研究对松露不同极性提取物进行抗氧化能力检测，筛选出抗氧化性最强的部位，对其进行秀丽线虫体内抗氧化测试，全面评价松露的抗氧化生物活性。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

新鲜松露（Tuber indicum），云南永仁县；秀丽隐杆线虫（C.elegans Bristol N2），中国农业大学张雅丽教授实验室赠予；大肠杆菌（E.coli）OP50，中国农业大学张雅丽教授实验室赠予。

石油醚、乙酸乙酯、甲醇（分析纯级），北京化工厂；铁氰化钾（分析纯级），国药集团；福林酚（分析纯级），索莱宝公司；胆固醇、酵母粉、蛋白胨（生物级），拜尔迪公司；5-氟-2，脱氧尿嘧啶（FUDR）、分子探针（生物级），Sigma-Aldrich 公司（中国）。

1.2 仪器与设备

LGJ-10 冷冻干燥机，北京四环科学仪器厂；SHB-III 循环水式真空泵，北京神泰伟业仪器公司；1650E 紫外分光光度计，北京普析通用仪器公司；超净工作台，北京东联哈尔仪器公司；体式显微镜，重庆奥特光学仪器公司；手提高压蒸汽灭菌锅，上海申安医疗器械公司；全温生化培养箱，上海培因仪器公司；荧光酶标仪，Bio Tech 公司（中国）。

1.3 松露不同极性提取物的制备

将新鲜松露切片，冷冻干燥粉碎成末，过40目筛。分别称取松露30 g，各加入300 mL 石油醚、乙酸乙酯、甲醇、水，冷凝回流分别提取2 h，取滤液，滤渣同上述方法再提取1 遍，合并提取液，旋蒸并干燥，分别获得石油醚提取物（PF）、乙酸乙酯提取物（EAF）、甲醇提取物（MF）、水提取（WF），4℃保存备用[8]。

1.4 松露不同极性部位体外抗氧评价

将上述松露不同极性提取物分别配成质量浓度为：5，10，20，30 g/L 的稀释液，做体外抗氧化测试。

1.4.1 羟基自由基清除能力测定 羟基自由基清除能力测定参照Zhao 等[9]的方法稍作修改。取20 mmol/L 水杨酸钠0.3 mL 和1.5 mmol/L 的硫酸亚铁1.0 mL 于各试管中，分别加入不同浓度的样品提取液1.0 mL，加入6 mmol/L 的H2O20.7 mL，迅速混匀，37 ℃恒温水浴1 h，于510 nm 波长下测定其OD 值。以无水乙醇为空白对照，VC 为阳性对照。

1.4.2 铁离子鳌合能力测定 参照Decker 等[10]的方法检测松露提取物铁离子螯合能力。铁离子螯合率按式（1）计算。

I（%）=[A0-（Ai-Aj）]×100/A0

式中，I——样品吸光率；A0——空白组吸光度；Ai——样品组吸光度；Aj——对照组吸光度。

1.4.3 松露总还原能力测定 分别取0.5 mL 不同样品，加入0.2 mol/L pH 6.6 磷酸盐缓冲溶液

2.5 mL，1%铁氰化钾[K3Fe（CN）6]溶液2.5 mL，混匀，50 ℃保温20 min，加入10%TCA 溶液2.5 mL，振荡混匀后离心10 min。取上清液2.5 mL，加蒸馏水2 mL 和0.1%FeCl3溶液0.5 mL。静置10 min，以等量去离子水调零，700 nm 波长处比色。以蒸馏水为阴性对照，以VC 为阳性对照[11]。

1.5 松露对秀丽线虫体内抗氧化评价

将松露不同极性提取物分别配成质量浓度为0，10，50，100 μg/mL 的稀释液，做体外抗氧化测试。

1.5.1 秀丽线虫寿命测定 将生长至L2 期的同期化秀丽线虫挑至含0，10，50，100 μg/mL 松露水提物的OP50 mNGM 培养板中，记为第1 天，此后每天在相同时间将存活的线虫转移至新平板中，记录每天存活的线虫数，直至全部线虫死亡。线虫的死亡标准为铂金铲触碰线虫无任何反应，丢失和爬到培养基壁上干死的线虫应从统计中剔除。试验中每组秀丽线虫不少于30 条，设置3 组重复。

1.5.2 秀丽线虫产卵量测定 挑取生长至L4 期的同期化的线虫，分别至含有不同浓度松露水提物的OP50 NGM 板中培养，每个板只放一条线虫单独培养。每天在相同时间把线虫挑至新培养基上，旧培养板在标准条件下继续培养12 h 后清点产卵量，直到线虫不再产卵，计算该线虫的产卵总量，即为其一生产卵数。每组15 条线虫，重复3次。

1.5.3 秀丽线虫急性应激能力测试 秀丽线虫急性压力应激测试参照Wilson 等[12]的方法，在压力应激试验中，将同期化虫卵在含不同浓度松露水提物的OP50 NGM 培养板中培养至成虫，将成虫暴露于不同的压力环境下，研究松露水提物对线虫压力应激的保护作用。每组试验秀丽线虫不少于30 条，重复3 次。

1） 秀丽线虫急性热应激 秀丽线虫急性热应激试验方法参照赵江等[13]的方法，稍作修改。将不同浓度药物处理的秀丽线虫和对照组线虫培养板置于35 ℃恒温恒湿箱中，每隔1 h 记录线虫的死亡数、剔除数，直至线虫全部死亡。

2） 秀丽线虫急性氧化应激 秀丽线虫急性氧化应激试验以H2O2为氧化剂，参照于周龙[14]的方法，稍作修改。将同期化的成虫置于含有4 mmol/L H2O2的M9 溶液的培养皿中，每隔1 h 记录线虫的死亡数、剔除数，直至线虫全部死亡。

1.5.4 秀丽线虫体内活性氧的测定 采用H2DCFDA 分子探针测定秀丽线虫体内的活性氧（Reactive oxygen species，ROS）[15]。同期化的线虫在标准条件下培养至成虫。在含有不同浓度松露水提物的培养板上培养48 h，用M9 缓冲液将线虫冲洗到黑色96 孔板中，每孔50 μL，并加入50 μL 分子探针，使分子探针的终浓度为50 μmmol/L。20 ℃温浴30 min，激发波长485 nm，发射波长538 nm条件下检测荧光强度，每隔30 min 检测1 次，检测2 h。检测完成后测定线虫蛋白浓度，计算ROS含量。

1.6 数据统计

数据采用SPSS 17.0 统计软件进行分析，应用单向方差分析（ANOVA）和邓肯氏法（Duncan’s）对数据在0.05 水平上检验显著性差异。用Origin 8 作图软件进行数据作图及分析。

2 结果与分析

2.1 松露提取物的体外抗氧化能力

2.1.1 松露提取物羟基自由基清除能力 松露不同极性提取物的羟基清除曲线如图1所示。

当提取物质量浓度为1 g/L 时，WF 和MF 的清除率接近50%，而EAF 和PF 的清除率约为35%；在质量浓度达到5 g/L 之前，WF 和MF 的清除曲线接近重合，说明在这一质量浓度区间，二者的羟自由基清除效果接近；当质量浓度达到10 g/L 时，WF 的清除率已经接近90%，并趋于稳定，而MF、EAF、PF 的清除率还较低；当质量浓度为30 g/L 时，MF、PF、EAF 的清除率分别达到最大值95.81%，75.76%，82.11%，而WF 的清除率可高达98.61%，清除效果与质量浓度为5 g/L 的VC 接近。以上清除曲线说明松露不同极性提取物均具有良好的羟基清除效果。李波等[16]对云南7 种其它食用菌进行羟自由基清除研究，结果发现，在同一浓度下，草菇、黑虎掌、竹荪等多种食用菌均具有一定的羟基自由基的清除效果，然而清除效果较差，最高清除率均低于50%。而松露WF 的羟基清除率最高可达98.61%，说明松露具有良好的羟自由基清除能力。

2.1.2 松露提取物铁离子螯合能力 松露不同极性提取物铁离子螯合曲线见图2。

如图2所示，WF 的铁离子螯合率在质量浓度为10 g/L 时趋于稳定，螯合率接近90%，最大可达93.22%，具有很好的铁离子螯合能力；MF 的螯合曲线在质量浓度为20 g/L 时，螯合率趋于稳定，最大值为91.16%，虽然MF 的最大螯合率与WF 相近，但在低剂量时，MF 的螯合能力明显弱于WF；EAF 和PF 的螯合曲线上升平缓，在质量浓度为1 g/L 时螯合率分别为35.83%和45.68%，当质量浓度达到30 g/L 时，螯合率增加至60.98%和69.55%，然而远低于WF、MF 相同质量浓度的螯合率。EDTA-2Na 具有良好的铁离子螯合能力，质量浓度为5 g/L 时，螯合率可以达到95.07%，相同质量浓度下，WF、MF 的螯合能力远不及EDTA-2Na。

图1 松露提取物的羟自由基清除曲线Fig.1 Hydroxy radical scavenging curve of truffle extract

图2 松露提取物铁离子螯合能力曲线Fig.2 The Fe3+ chelation ability curve of truffle extract

2.1.3 松露提取物的总还原能力 由图3可知，4种极性提取物的还原能力排序WF＞MF＞EAF＞PF。WF 和MF 在质量浓度在1～10 g/L 之间，还原能力与质量浓度约成线性正相关，且二者在这一质量浓度区间的还原能力差异不明显；当质量浓度达到10 g/L 后，质量浓度对WF、MF 的还原能力影响减少，然而WF 开始表现出更大的还原能力；当质量浓度为30 g/L 时，WF 和MF 的最大吸光值分别达到2.221 和2.011，接近VC 的最大吸光值，相同质量浓度下，WF 和MF 的还原能力远小于VC。EAF 和PF 的还原能力较弱，质量浓度为5 g/L 时，二者的还原能力接近，质量浓度大于5 g/L 时，EAF 的还原能力明显强于PF，EAF 的吸光值最大可达0.941，而PF 的最大吸光值为0.608。

图3 松露提取物的总还原能力曲线Fig.3 Total reduction capacity curves of the extracts

2.2 松露对秀丽线虫的影响

2.2.1 松露水提物对秀丽线虫寿命的影响 标准培养条件下，野生型秀丽线虫的寿命约为2～3 周，分别用0，10，50，100 μg/mL 的松露水溶液处理秀丽线虫，发现松露对秀丽线虫的寿命延长有显著促进作用（P＜0.05）。如图4、表1所示。

由图4可见，对照组的秀丽线虫最长寿命为13 d，而10，50，100 μg/mL 处理组的最长寿命分别为18，16，16 d，分别延长5，3，3 d。由此可知，50 μg/mL 处理组对松露对秀丽线虫的寿命延长效果最显著。

空白对照组的秀丽线虫平均寿命为9.06 d，而10，50，100 μg/mL 处理组的平均寿命相对于空白组分别延长了18.68%，31.86%，15.71%，且当松露水提物质量浓度为50 μg/mL 时效果最显著。当松露质量浓度上升到100 μg/mL 时，寿命延长效果有所下降，说明过量的松露水提物会对线虫有细胞毒性。

2.2.2 松露水提物对秀丽线虫生殖能力的影响野生型秀丽线虫一生中的产卵量受环境、传代数等多种因素的影响。分别用10，50，100 μg/mL 质量浓度的松露水提物处理秀丽线虫，检测秀丽线虫的产卵量，结果发现松露水提物能有效增加秀丽线虫的产卵量。如图5，表2所示。

图4 松露对秀丽线虫寿命的影响Fig.4 The effect of truffles on the life span of C.elegans

图5 松露对秀丽线虫产卵量的影响Fig.5 Effect of truffle on fecundity of C.elegans

表1 不同质量浓度松露水提物对秀丽线虫平均寿命的影响Table 1 Effects of different mass concentrations of truffle extracts on the average life span of C.elegans

表2 不同质量浓度松露水提物对秀丽线虫产卵量的影响Table 2 Effects of different mass concentrations of truffle extract on fecundity of nematodes

由表2可知，对照组线虫一生的产卵量为197 个，而10，50，100 μg/mL 处理组的线虫产卵量分别增加到221，269，234 个，产卵的增加率分别为12.18%，36.55%，18.78%，与对照组相比有显著差异。且以50 μg/mL 的质量浓度处理组对秀丽线虫的生殖促进作用最明显。

2.2.3 急性热应激条件下松露水提物对秀丽线虫寿命的影响 压力环境应激能力是指生物体在外界生存环境变得恶劣下的抗逆能力，压力环境越恶劣，生物体生存周期越长，证明生物体的压力应激能力越好。秀丽线虫在不同质量浓度松露水提物干预条件下的应激寿命如图6，表3所示。

由图6可知，对照组秀丽线虫在35 ℃急性热应激环境下的最长寿命为8 h，而10，50，100 μg/mL 处理组的线虫的最长寿命分别为9，11，10 h，把秀丽线虫的应激寿命分别延长了1，3，2 h。

由表3可知，正常对照组秀丽线虫的急性热应激平均寿命为5.75 d，而10，50，100 μg/mL 的松露水提物质量浓度处理的秀丽线虫平均寿命分别为 （6.15±0.05），（7.40±0.10），（6.75±0.15）d，相对寿命延长率可达6.96%，28.70%，17.39%，其中50 μg/mL 的质量浓度处理组对秀丽线虫的寿命延长效果最显著。

2.2.4 急性氧化应激条件下松露水提物对秀丽线虫寿命的影响 将野生型秀丽线虫放入4 mmol/L的H2O2溶液中造成氧化应激条件，造成秀丽线虫的急性氧化损伤。分别用0，10，50，100 μg/mL 的松露水溶液预处理线虫48 h 后，挑入H2O2溶液的6 孔板中，每隔1 h 检测线虫存活量。松露水提物对秀丽线虫急性氧化应激的影响如图7，表4所示。

图6 急性热应激下松露对秀丽线虫寿命的影响Fig.6 Effects of truffle on longevity of C.elegans under acute hot stress

图7 急性氧化应激下松露对秀丽线虫寿命的影响Fig.7 Effects of truffle on longevity of C.elegans under acute oxidative stress

表3 急性热应激下不同质量浓度松露提取物对秀丽线虫的影响Table 3 Effects different mass concentrations of truffle extracts on C.elegans under acute hot stress

从线虫的生存率曲线中，可以看出，对照组线虫的氧化应激最长寿命为7 h，而10，50，100 μg/mL 的松露处理组线虫的最长寿命分别提高到10，8，8 h，比对照组多存活了3，1，1 h。

对照组秀丽线虫在H2O2急性氧化应激下的平均寿命为（4.20 ± 0.20） h，而10，50，100 μg/mL松露处理组的秀丽线虫平均寿命分别为 （5.15 ±0.15），（6.70±0.10），（5.35±0.25）h，寿命相对延长率为22.61%，59.52%，27.38%。说明松露对急性氧化应激下的秀丽线虫有显著保护作用（P＜0.05），可以有效降低秀丽线虫对氧化损伤的敏感度，提高氧化条件下的抗逆能力，且当松露质量浓度为50 μg/mL 时效果最佳。

2.2.5 松露对秀丽线虫体内活性氧生成量的影响

ROS 是需氧细胞在代谢过程中产生的一系列活性基团，适量的ROS 可双向调控某些肿瘤细胞的凋亡和增殖，是人体中维持生理平衡的重要物质[17]。然而过量的ROS 会引起机体氧化应激反应，导致细胞损伤或凋亡，从而引发动脉粥样硬化、癌症、心脑血管病症等多种疾病[18]。本试验用H2DCF-DA 分子探针检测了不同质量浓度松露对秀丽线虫体内活性氧的影响如图8所示。

由图8可知，线虫体内的ROS 水平随反应时间的延长而增加。对照组线虫体内ROS 在2 h 时可达303.45%，而松露水提物处理可以有效降低线虫的ROS 水平上升趋势，10 μg/mL 的松露水提物处理的线虫2 h 后体内ROS 为248.78%，相比对照组降低了54.67%；50 μg/mL 的松露水提物处理的线虫ROS 为206.86%，相比对照组降低了96.59%；100 μg/mL 的松露水提物处理后ROS 为238.21%，相比对照组降低了65.24%。以上数据表明，松露水提物能有效清除线虫体内的ROS，且以50 μg/mL 的松露水提物对ROS 清除效果最为显著（P＜0.05）。

3 结论

以松露不同极性提取物为对象，对其进行体外抗氧化能力评价以及秀丽线虫体内抗氧化测试，获得全面的松露抗氧化数据。结果表明，松露具有良好的体外、体内抗氧化能力。松露不同极性提取物的抗氧化性存在显著差异，综合抗氧化能力排序为WF＞MF＞EAF＞PF，且抗氧化能力排序与提取溶剂的极性大小排序一致，说明松露中主要的抗氧化活性成分为极性较大的物质，易被极性较大的物质提取；松露水提物可以有效清除线虫体内的ROS，降低其氧化应激水平。50 μg/mL 松露处理可将线虫的平均寿命增加31.86%，产卵量可从对照组的197 个增加到269 个。同时，松露水提物可以显著降低秀丽线虫在急性应激条件下的敏感性，延长线虫应激条件下的寿命。未来可继续深入探究松露的抗氧化机理和促进生殖功能，为松露功能性食品的开发提供理论支撑。