竹叶提取物流化冰与迷迭香提取物流化冰处理对鲈鱼贮藏期间抗氧化活性及微生物作用影响

张皖君 蓝蔚青，2* 胡旭敏 赖晴云 谢 晶，2

（1 上海海洋大学食品学院 上海201306 2 上海水产品加工及贮藏工程技术研究中心 食品科学与工程国家级实验教学示范中心（上海海洋大学）上海201306）

鲈鱼（Lateolabrax japonicus）又名花鲈、四肋鱼等，主要分布于我国近海及河口海水、淡水交汇处，其肉质白嫩，脂肪含量较高，且骨刺较少，是我国高档淡水鱼品种之一。近年来，我国的鲈鱼产量呈逐年递增态势。其中，2018年鲈鱼海水养殖产量为166 581 t，较2017年增长了6.38%。然而，由于鲈鱼肉中的蛋白质和不饱和脂肪酸含量较高，贮藏过程中易发生蛋白质降解与脂肪氧化等现象，严重影响其货架期。冰藏是常用的水产品保鲜方法，其能抑制鱼体内酶的活性及微生物的生长繁殖[1]。

流化冰（Slurry ice，SI）作为一种快速冷却水产品的保鲜方法，现已得到普遍关注[2]。该法具有流动性好，对水产品物理损伤小，可直接利用海水等优势。其载冷能力高，在贮藏过程中可将鱼体快速降温，达到微冻状态。同时，可抑制鱼体内微生物的生长，钝化内源酶的活性，提升其综合品质[3]。然而，低温条件并不能完全阻止鱼体的生化反应和有害微生物的繁殖。为获得更佳的流化冰保鲜效果，可通过栅栏技术，适量添加具有抗氧化活性的植物源保鲜剂，实现低温保鲜、抑菌与抗氧化的协同效果。抗氧化剂是抑制肉制品脂肪和蛋白质氧化，广泛采用的最直接有效的措施。

竹叶抗氧化物（Antioxidant of bamboo，AOB）是从竹叶中提取的多酚类物质，根据GB 2760-2014 食品添加剂使用标准规定，其被卫生部批准作为天然食品抗氧化剂使用，可用于水产品、肉制品、膨化食品等食品中[4]。AOB 有效成分主要为黄酮、内酯和酚酸类化合物，具有抑菌、抗菌、抑制脂质过氧化等多重活性[5]。张晓丽等[6]研究表明AOB对鲜罗非鱼片具有良好的抗菌和抗氧化作用，0.1 g/100mL AOB 处理的罗非鱼片比对照组样品货架期延长4～6 d。迷迭香提取物（Rosemary extract，RE）是从迷迭香中提取的非挥发性混合物，主要成分为萜类、黄酮、酚类等物质，也具有抑菌和抗氧化双重功效，可通过减缓自由基的链式反应，以延迟产品的氧化变质，同时还能改善口感，提升产品品质[7]。Yang 等[8]研究表明RE 可降低植物油过氧化值，延缓多不饱和脂肪酸和生育酚的降解，能有效替代合成抗氧化剂在食品保鲜中应用。

目前，关于流化冰的研究主要在其预冷、运输保鲜等方面，而将植物源保鲜剂制成流化冰后用于水产品保鲜的研究较少。因此，本文分别使用竹叶抗氧化物流化冰与迷迭香提取物流化冰对鲈鱼进行冰藏处理，研究其对鲈鱼贮藏期间抗氧化活性及微生物作用的影响，探究其协同作用效果，为提升产品品质，延长水产品的货架期提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 材料

鲈鱼，上海市浦东新区农工商超市，选取体长30～35 cm，均重（500±20）g 样品，保持鱼样均一，30 min 内充氧运往实验室。

1.2 主要试剂

AOB（优质食品级，总黄酮含量≥40.0%，异荭草苷含量≥2.0%），浙江圣士生物科技有限公司；RE（食品级，提取物含量22%±4%），贵州红星发展都匀绿友有限责任公司；丙二醛（MDA）试剂盒，南京建成生物有限公司；三氯乙酸、乙酸乙酯、乙醇、乙二胺四乙酸（EDTA）、Tris-base、平板计数琼脂、氯化钠、2，4-二硝基苯肼、NaH2PO4、Na2HPO4、无水乙醇等均为国产分析纯级。

1.3 主要仪器及设备

RE-1000W-SP 型流化冰机，江苏南通瑞友工贸有限公司；MLS-3750 型灭菌锅，日本SANYO公司；722 可见分光光度计，上海佑科仪器仪表有限公司；H-2050R 型台式高速冷冻离心机、BIOBASE-EL 10A 自动酶标仪，湖南湘仪实验室仪器开发有限公司；生化培养箱，上海一恒科学仪器有限公司；JX-05 拍打式无菌均质器，上海净信实业发展有限公司。

1.4 试验方法

1.4.1 试验设计 将鲜活鲈鱼采用碎冰猝死后，清洗去污，随机分成3 组，每组16 条，第1 组样品采用流化冰处理为对照组（SI）；第2 组使用0.1%竹叶抗氧化物制成流化冰后进行冰藏处理（AOBSI）；第3 组使用0.1%迷迭香提取物制成流化冰后进行冰藏处理 （RE-SI）。3 组冰浆均由80%冰+20%水组成，冰体温度为-1.8 ℃左右，每组鲈鱼按层冰层鱼的方式放在泡沫箱中，最后一层冰要求覆盖住鱼体，置于4 ℃冷藏环境中。试验期间，根据需要及时更换补充冰，保持体系温度恒定，定期取样测定样品的各项指标。

1.4.2 感官分析 根据AOAC[9]规定，参照李颖畅等[10]的方法，稍作修改。由5 位专业感官评定员参照表1分别从样品外观、气味、眼睛、鱼鳃、黏液与弹性等6 个方面进行评分，各项所得的平均值为最终的感官评分值，综合分值在8～10 分为新鲜，5～7 分为较新鲜，3～4 分为一般，3 分以下为不可接受。

表1 鲈鱼感官评定表Table 1 Sensory evaluation standard of Lateolabrax japonicas

1.4.3 过氧化值（Peroxide value，POV） 参照GB 5009.227-2016[11]食品安全国家标准 食品中过氧化值的测定方法测定样品的过氧化值。

1.4.4 丙二醛 （Malondialdehyde，MDA） 采用丙二醛（MDA）试剂盒测定样品中MDA 含量。

1.4.5 游离脂肪酸 （Free fatty acid，FFA） 参考Lowry 等[12]法，稍作修改。称取0.1 g 脂肪样品溶于5 mL 甲苯中，加入5 mg/mL 的吡啶乙酸铜溶液1 mL，混合物振荡5 min 后，在3 000 r/min 下离心10 min，取上层溶液于715 nm 下测定吸光值。平行测定3 次，结果用“g 游离脂肪酸FFA/100 g 脂肪”表示。

1.4.6 蛋白质氧化评价 以羰基和巯基的变化作为鱼肉中蛋白质的氧化程度评价指标。

1.4.6.1 肌原纤维蛋白提取 参考邓思瑶等[13]肌原纤维蛋白提取方法，略作修改。取3.0 g 肌肉组织与5 倍体积pH 值为6.8 的磷酸盐缓冲溶液（PBS）混合匀浆，10 000 r/min，4 ℃离心10 min，弃上清液，重复3 次。取沉淀，加入相同体积0.7 mol/L 氯化钠溶液，4 ℃，10 000 r/min 高速冷冻离心20 min，所得上清液为肌原纤维蛋白溶液。

1.4.6.2 羰基含量 参照Oliver 等[14]的方法，取1.0 mg 肌原纤维蛋白，每管中加入1 mL 10 mmol/L 2，4－二硝基苯肼，室温反应1 h（每10 min 旋涡振荡1 次），添加1 mL 20%三氯乙酸，8 000 r/min离心5 min，温控4 ℃，弃上清液，用1 mL 乙酸乙酯∶乙醇（体积比1∶1）清洗沉淀3 次以除去未反应试剂，加入3 mL 6 mol/L 盐酸胍溶液，置于37 ℃条件下，水浴15 min 使沉淀溶解，再将反应液8 000 r/min 离心3 min 除去不溶物质，所得上清液在370 nm 波长处测吸光值，使用分子吸光系数22 000 L/（mol·cm）计算羰基含量，羰基含量单位为nmol/mg，计算方法见式（1）。

式 中，ε——分子吸光系数，L/（mol·cm）；b——比色皿宽度，cm；c——浓度，mol/L。

1.4.6.3 巯基含量 按照Soyer 等[15]法，略作修改，取肌原纤维蛋白5 g，加入200 mmol/L Tris-HCl 缓冲液 （2%SDS 和10 mmol/L EDTA，pH 6.8），稀释后取4 mL，加入0.4 mL 1%DTNB，于40 ℃恒温水浴中放置25 min，在412 nm 波长处测定吸光值。用0.6 mol/L KCl 与20 mmol/L Tris-HCl 提取液取代样品，作空白对照。

1.4.7 菌落总数 根据GB 4789.2-2016 菌落总数《食品微生物学检验数测定》[16]中的平板计数法进行测定。称取10 g 鱼肉于灭菌袋中，加入90 mL 0.85%无菌生理盐水，拍打均匀，以10 倍梯度稀释，取3 个合适的稀释度，各取1 mL 于无菌培养皿内，每个稀释度作3 个平行，在（30±1）℃条件下培养72 h 后计数，单位用CFU/g 表示。

1.5 数据处理

通过统计软件SPSS13.0 中的Pearson 相关系数、ANOVA 单因素方差及Duncan 新复极差法进行数据的差异与相关性分析，利用软件Origin（Pro）8.5 绘图。最终试验数据均为3 次平行试验的平均值，且结果以平均值±标准差表示。

2 结果与分析

2.1 感官评价

感官品质是影响消费者购买水产品的重要因素，也是衡量产品新鲜度的最直接和重要的评价指标[17]。

图1 不同流化冰处理对鲈鱼感官分值变化的影响Fig.1 Effects of different slurry ice treatments on the change of sensory score in Lateolabrax japonicas

由图1可知，样品的感官分值随贮藏时间的延长逐渐降低。其中，两种植物源保鲜剂流化冰处理组样品的感官分值降幅均显著小于对照组（P＜0.05）。对照组样品贮藏至第15 天时，样品体表光泽暗淡，肉质柔软，弹性变差，产生腥臭味；在第18 天时，其感官分值已降至2.60±0.22，低于感官评分可接受值。而AOB-SI 和RE-SI 处理组样品的感官评分值较接近，均显著优于SI 组（P＜0.05）。处理组样品贮藏至18 d 时，感官分值分别为3.10±0.15，3.23±0.32，整体感官质量仍高于可接受值。由此可知，AOB-SI 与RE-SI 可显著延缓鲈鱼肉感官分值的下降速度，延长其货架期。

2.2 过氧化值（POV）

POV 是衡量脂质氧化的一级氧化产物，其可检测肉中脂肪氧化中间产物的积累量。过氧化物的性质一般不稳定，其在贮藏期间易降解成醛、酮类、羟基酸等小分子化合物[18]。脂质氧化后，鱼贝类会产生不愉快的刺激性臭味、酸味等，严重降低其食用品质[19]。不同流化冰保鲜处理对鲈鱼冰藏期间POV 值变化的影响如图2所示。

由图2可知，3 组鲈鱼样品的POV 值在冰藏期间迅速上升。其中，对照组样品的POV 值在第15 天达到最大值，随后呈下降趋势。可能由于冰藏后期初级脂肪氧化产物的降解速度高于其生成速度[20]。Fidalgo 等[21]利用不同压力条件对大西洋鲑鱼进行贮藏，结果均显示POV 值呈先升后降的趋势。AOB-SI 和RE-SI 组样品的POV 值在冰藏期间呈不断上升的特点，未出现先升后降的变化趋势，结果表明AOB 和RE 能明显抑制氢过氧化物的降解。在冰藏前16 d，经AOB-SI 和RE-SI 处理样品的POV 值显著低于SI 组，由此可知，植物源保鲜剂流化冰能有效抑制鱼肉氢过氧化物的形成。贮藏中后期，AOB-SI 处理组样品的POV 值低于RE-SI 处理组，表明AOB-SI 对脂肪初级氧化产物的抑制效果优于RE-SI。

2.3 MDA 值

MDA 是脂肪氧化的次级产物，其含量高低可衡量细胞受自由基攻击的损伤程度。机体内的氧自由基可攻击生物膜中的多不饱和脂肪酸，使脂质发生过氧化作用，从而生成脂质过氧化物[22]。不同流化冰处理组样品的MDA 值变化情况如图3所示。

图2 不同流化冰处理对鲈鱼POV 值变化的影响Fig.2 Effects of different slurry ice treatments on the change of POV value in Lateolabrax japonicas

图3 不同流化冰处理对鲈鱼MDA 值变化的影响Fig.3 Effects of different slurry ice treatments on the change of MDA value in Lateolabrax japonicas

由图3可知，新鲜鲈鱼的初始MDA 值为（4.65±0.51）nmol/mL。随着冰藏时间的延长，各组样品的MDA 值均呈上升趋势。其中，对照组样品的MDA 值上升最快，在贮藏24 d 时的MDA 值达（21.84±0.89）nmol/mL，而AOB-SI 与RE-SI 处理组样品的MDA 值分别为 （16.29 ± 0.68） nmol/mL 和 （17.56±0.45）nmol/mL。同时，AOB-SI 与RE-SI 组样品间差异不显著（P＞0.05）。因此，AOB与RE 可改善样品的抗氧化性能，有效清除机体内的氧自由基、螯合金属离子，保护细胞膜的完整性，对鲈鱼肉具有较好的保鲜效果。该结果与吴昊等[23]与贾娜等[24]的研究结果一致。

2.4 游离脂肪酸（FFA）含量

游离脂肪酸是由三酰甘油经化学水解或酶促水解产生[25]，是判断水产品脂肪水解程度的重要指标，测定脂质水解能反映其氧化程度[20]。

如图4所示，3 组样品在整个冰藏过程中的脂肪水解程度不断增大，对照组样品的FFA 增幅明显快于处理组样品。其中，对照组样品FFA 含量在12 d 前迅速升高，后趋于平缓，表明样品贮藏后期的脂质分解速度与脂肪酸氧化速率一致。AOB-SI 与RE-SI 组样品的FFA 含量始终上升缓慢。24 d 时，对照组样品的FFA 值为27.58 g/100 g，明显高于AOB-SI 与RE-SI 组。结果表明，竹叶抗氧化物与迷迭香提取物对鲈鱼的脂肪水解和游离脂肪酸形成有显著影响。可能由于AOB 与RE中的黄酮、内酯与双酚类化合物能更好的抑制酶的活性。

2.5 肌原纤维蛋白羰基含量

鱼肉在贮藏期间，其肌原纤维蛋白中的部分氨基酸残基易受自由基攻击，使蛋白质的氧化过程受到催化，形成羰基。因此，羰基含量是评价蛋白质氧化的通用指标之一[26]。不同流化冰处理的鲈鱼肌原纤维蛋白羰基含量的变化如图5所示。

图4 不同流化冰处理对鲈鱼FFA 含量变化的影响Fig.4 Effects of different slurry ice treatments on the change of FFA content in Lateolabrax japonicas

图5 不同流化冰处理对鲈鱼肌原纤维蛋白羰基含量变化的影响Fig.5 Effects of different slurry ice treatments on the change of carbonyl content of myofibrillar protein in Lateolabrax japonicas

由图5可知，3 组鲈鱼样品的羰基值均随着冰藏时间的延长而增加，对照组样品在贮藏前15 d 的上升趋势明显，在贮藏末期达最大值。而AOB-SI 与RE-SI 组样品的羰基含量均低于对照组。由此说明，竹叶抗氧化物和迷迭香提取物可使蛋白质羰基含量降低，起到抗蛋白氧化的作用。除第8 天外，AOB-SI 组的羰基值均低于同期的RESI 组样品，表明AOB-SI 抑制蛋白质氧化的效果略优于RE-SI，这与抑制脂肪氧化的结果一致。Estévez 等[27]发现法兰克福香肠在冷藏过程中的蛋白质羰基值与脂质氧化的羰基价相关系数达0.85（P＜0.05），两者显著相关。冰藏期间鲈鱼肉的脂质氧化程度增加，可能是导致蛋白质氧化的诱因之一。

2.6 肌原纤维蛋白巯基含量

天然蛋白质中包埋许多疏水基团和巯基，巯基氧化会生成二硫键及其它氧化产物。因此，巯基含量也是评价蛋白质氧化的另一重要指标[28]。

如图6所示，不同流化冰处理条件下鲈鱼肉肌原纤维蛋白的巯基含量随贮藏时间的延长呈显著下降的趋势。AOB-SI、RE-SI 与SI 样品贮藏12 d 后，其总巯基含量分别下降了27.73%，31.10%与39.95%，变化显著。24 d 时，总巯基含量分别为2.38 mg/105 g，2.46 mg/105 g 与2.11 mg/105g。通过与脂肪氧化结果对比可知，AOB-SI、RE-SI 对蛋白质的抗氧化效果不太显著。Tironi 等[29]研究RE对鲑鱼糜脂肪氧化和蛋白氧化的抑制作用，结果表明迷迭香提取物能有效抑制鱼糜的脂肪氧化，然而不能有效延缓蛋白的劣变过程。巯基含量下降主要由于肌球蛋白发生降解，导致蛋白质空间结构改变，致使埋藏于蛋白质分子内部的巯基暴露出来而氧化[30]。结果表明，经AOB-SI 和RE-SI处理的鲈鱼鱼肉肌原纤维蛋白的总巯基始终高于SI 组，主要由于植物源保鲜剂流化冰能有效抑制鱼肉蛋白质变性与巯基自动氧化，降低其蛋白质的变性聚合程度。

2.7 菌落总数

菌落总数变化可反映蛋白质和氨基酸分解代谢情况，因此测定菌落总数是衡量鲈鱼腐败程度的重要参数。Al-Daqal 等[31]提出水产品可食用的菌落总数上限为6.0 lg（CFU/g）。

如图7所示，第0 天鲈鱼初始菌落数为3.81 lg（CFU/g），表明该批样品符合新鲜度要求[32]。贮藏初期，样品菌落总数升幅较缓，这是由于微生物仍处于适应期。当鱼体进入自溶阶段后，微生物开始迅速从表面侵入到组织内部，并快速繁殖。其中，SI 组样品菌落总数的增长速度最快，在第15 天时为5.91 lg（CFU/g），18 d 达6.11 lg（CFU/g），鱼肉已腐败[33]，而同期的AOB-SI 和RE-SI 组菌落总数分别为5.57 lg（CFU/g）和5.64 lg（CFU/g），低于SI 组，处于可接受范围。SI、AOB-SI 和RE-SI 组样品到贮藏末期时的菌落总数分别为初始值的1.66，1.58，1.51 倍，表明AOB-SI 与RE-SI 的抑菌效果更显著。现有研究表明，AOB 中的黄酮类物质能通过抑制细菌新陈代谢所需的酶类活性达到抑菌目的[34]。迷迭香中的迷迭香酸、迷迭香酚与鼠尾草酚等二萜酚类化合物被认为能改变细菌细胞膜完整性与通透性，实现抑菌效果[35]。AOB-SI 和RE-SI 组在冰藏后期增长迅速，可能是AOB 与RE 的抑菌作用减弱，自溶和腐败期微生物利用蛋白大分子，促进微生物增长[36]。

2.8 相关性分析

图6 不同流化冰处理对鲈鱼肌原纤维蛋白巯基含量变化的影响Fig.6 Effects of different slurry ice treatments on the change of sulfhydryl content of myofibrillar protein in Lateolabrax japonicas

图7 不同流化冰处理对鲈鱼菌落总数变化的影响Fig.7 Effects of different slurry ice treatments on the change of TVC in Lateolabrax japonicas

将鲈鱼贮藏期间的脂肪氧化、蛋白质氧化指标和微生物测定结果通过皮尔森相关系数分析，以明确各类指标间的相关性，结果如表2所示。

表2 鲈鱼贮藏期间的脂肪氧化、蛋白质氧化和微生物指标间的皮尔森相关系数分析Table 2 Analysis of Pearson correlation coefficients in Lateolabrax japonicas between lipid oxidation，protein oxidation and microbial indicator during storage

由表2可知，鲈鱼的感官分值仅与MDA 值显著不相关，与其它指标间的相关度均较高。FFA 值与MDA、POV 值呈极显著正相关，相关系数分别为0.992 和0.902，说明测定鱼肉脂肪水解指标能反映其脂肪氧化程度[20]，这与前文FFA 的分析结果相一致。鲈鱼肌原纤维蛋白羰基含量与MDA、POV、FFA 值呈显著正相关，相关系数分别为0.836、0.811 和0.859，巯基含量与MDA、POV、FFA 值呈极显著负相关（P＜0.01）。结果表明，冰藏期间鱼肉的脂肪氧化程度与蛋白质品质密切相关，通过测定鲈鱼样品的脂肪氧化指标，可反映鱼肉蛋白质的氧化性能。有学者发现蛋白质氧化与脂质氧化之间存在相互促进的关系，脂质氧化过程中，生成的自由基、氢过氧化物和醛类等物质加速了蛋白质氧化损伤。同时，蛋白质的氧化（尤其是肌红蛋白）导致铁离子的释放，反之，又会加速脂肪氧化，从而造成肉及肉制品色泽的劣变[37]。其中，陆玉芹[38]与Baron 等[39]均发现，贮藏期间鱼肉中的羰基含量与TBARS 值变化趋势一致，脂质氧化产生的氢过氧化物可诱导鱼肉蛋白质羰基含量増加。在反映鱼肉新鲜度方面，除FFA 外，TVC 值与其它指标相关性大，其中与肌原纤维蛋白巯基含量呈极显著负相关，与MDA、POV 和羰基含量呈正相关，说明鲈鱼在冰藏过程中，其微生物生长繁殖的同时，也会导致鲈鱼脂肪和蛋白质发生氧化降解。

3 结论

与SI 组样品相比，AOB-SI、RE-SI 处理组可显著抑制鲈鱼肉的脂质水解与氧化，抑制微生物生长和鱼肉蛋白质氧化，延缓样品的腐败变质，具有良好的抑菌和抗氧化作用。其冰藏货架期与SI处理组相比，延长了3～6 d。综合来看，AOB-SI 组的抗氧化和抑菌效果在贮藏中后期略优于RESI，这也为进一步探究AOB、RE 的适宜添加浓度提供了数据支持。由相关性分析表明，经不同保鲜技术处理的鲈鱼鱼肉中脂质氧化、蛋白质氧化及微生物变化间具有良好的相关性。流化冰与植物源保鲜剂结合，可充分发挥复合保鲜剂的抑菌和抗氧化作用，弥补因操作不当引起微生物感染的劣势，使流化冰保鲜技术在鲈鱼流通中得到有效应用，这种协同技术在水产品保鲜中具有一定应用前景。