花生粕制备复合氨基酸螯合锌的研究
2019-08-22解成骏李洪潮张文强徐怀春
解成骏,李洪潮,张文强,刘 俊,徐怀春
(文山学院 化学与工程学院, 云南 文山 663009)
微量元素氨基酸金属螯合物有特定的生化特性,其吸收方式、代谢途径、安全性均优于无机微量元素,具有较高的生物学效价,有益于动物的吸收利用。特定的氨基酸金属螯合物是合成动物、人体体液及各种脏器细胞的重要原料,被广泛用于食品、医药、农药、饲料等行业,其前景广阔[1]。
花生粕中蛋白质含量高达48%~50%,氨基酸种类齐全,其中天门冬氨酸、谷氨酸、精氨酸含量分别为4.426%、7.572%、4.919%[2],以花生粕为原料,制备氨基酸金属螯合物,可综合利用花生粕等富含蛋白质的废弃物,应用前景好。
成人体内锌含量为1.4~3.0 g,广泛分布于人体的各种组织、器官中,对人体的免疫系统、神经系统、代谢系统、生长发育、智力等方面有重要的影响[3-4]。
构成蛋白质的各种氨基酸与各种金属盐形成金属螯合物的能力不同,螯合物稳定性也有差异[5]。本研究在大豆粕制备复合氨基酸螯合铜的基础上[6],研究花生粕制备复合氨基酸螯合锌,扩展了应用研究,该工艺成熟、简单,条件易控,产率高。
1 材料与方法
1.1 实验材料
花生粕,购自云南昆明农贸市场。
复合氨基酸(98%)(LR 250 g)(ID 242405;No 141819),北京北纳创联研究院;氯化锌、乙二胺四乙酸二钠、溴化钾等均为分析纯。
瑞士Precisa XA220A电子天平;IRprestige-21傅里叶变换红外光谱仪,日本岛津。
1.2 实验方法
1.2.1 复合氨基酸的制备
取花生粕50.0 g,用200 mL、6 mol/L盐酸恒温90℃回流8 h,热滤,滤液用5.0 g活性炭恒温50℃搅拌10 min,趁热抽滤除杂质、脱色,所得滤液用氢氧化钠调节pH为5~6,浓缩结晶得到复合氨基酸粗品。将氨基酸粗品用50 mL冰乙酸恒温85℃回流50 min,趁热抽滤除盐,滤液用其8倍体积的丙酮结晶、抽滤,再用无水乙醇洗涤晶体2~3次除油脂,干燥,得到较纯复合氨基酸。
1.2.2 复合氨基酸螯合锌的制备
称取一定量自制的复合氨基酸溶解于50 mL水中,再加入一定量氯化锌,滴加3 mol/L醋酸溶液,调节pH到一定值,在一定的螯合温度下充分搅拌反应一定时间后,将滤液冷却到室温,抽滤除去不溶性杂质,滤液加入其8倍体积的甲醇,静置20 min充分结晶,抽滤得到白色结晶,用无水乙醇洗涤2~3次,真空干燥,得到目标产品复合氨基酸螯合锌。
1.2.3 复合氨基酸螯合锌制备工艺探究
选择复合氨基酸标准品,根据其含量计算平均氨基酸的物质的量。将复合氨基酸标准品与氯化锌在一定的物质的量比、螯合温度、螯合时间、体系pH等螯合条件下,改变其中1个因素,固定其余3个因素,制备复合氨基酸螯合锌,以锌的螯合率为衡量标准确定制备复合氨基酸螯合锌的单因素条件,在单因素实验的基础上设计正交实验确定最佳工艺条件。
1.2.4 复合氨基酸、复合氨基酸螯合锌的红外光谱(IR)表征
先用纯溴化钾进行背景扫描,再将压好的压片放到红外光谱仪上进行扫描,分别测定复合氨基酸标准品,制备的复合氨基酸、复合氨基酸螯合锌在4 000~400 cm-1的红外光谱。
1.2.5 EDTA法测定金属锌含量
称取一定量的复合氨基酸螯合锌产品于250 mL锥形瓶中,加入2.0 mL 1 mol/L的硫酸溶液,搅拌溶解,加50 mL蒸馏水,再加入20 mL pH 5.4六亚甲基四胺缓冲溶液和2~3滴二甲酚橙指示剂,用0.021 2 mol/L的EDTA标准溶液滴定至终点,重复3次。按下式计算产品中锌含量。
WZn=CEDTA×VEDTA×65.41/(1 000×m)×100%
式中:WZn为锌含量,%;CEDTA为EDTA标准溶液的浓度,mol/L;VEDTA为滴定消耗EDTA标准溶液的体积,mL;65.41为锌的摩尔质量,g/mol;m为产品试样的质量,g。
2 结果与分析
2.1 单因素实验
2.1.1 复合氨基酸标准品与氯化锌物质的量比对螯合反应的影响
选取复合氨基酸标准品与氯化锌物质的量比按1∶1、2∶1、3∶1、4∶1(总量小于10.0 g),用醋酸控制螯合体系pH为4,螯合温度60℃,螯合时间1 h,按1.2.2方法制备复合氨基酸螯合锌,考察复合氨基酸标准品与氯化锌物质的量比对螯合反应的影响,结果见表1。
表1 复合氨基酸标准品与氯化锌物质的量比对螯合反应的影响
由表1可知,当复合氨基酸标准品与氯化锌物质的量比为2∶1时,复合氨基酸螯合锌中锌的螯合率最大,为80.23%。
2.1.2 体系pH对螯合反应的影响
选取复合氨基酸标准品与氯化锌的物质的量比2∶1,用醋酸调控螯合体系pH分别为4、5、6、7,控制螯合温度60℃,螯合时间1 h,按1.2.2方法制备复合氨基酸螯合锌,考察体系pH对螯合反应的影响,结果见表2。
表2 体系pH对螯合反应的影响
由表2可知,当螯合体系pH为4时,复合氨基酸螯合锌中锌的螯合率最大,为80.24%。
2.1.3 螯合温度对螯合反应的影响
选取复合氨基酸标准品与氯化锌的物质的量比2∶1,用醋酸调控螯合体系pH为4,控制螯合温度分别为40、50、60、70℃,螯合时间1 h,按1.2.2方法制备复合氨基酸螯合锌,考察螯合温度对螯合反应的影响,结果见表3。
表3 螯合温度对螯合反应的影响
由表3可知,当螯合温度为50℃时,复合氨基酸螯合锌中锌的螯合率最大,为83.46%。
2.1.4 螯合时间对螯合反应的影响
选取复合氨基酸标准品与氯化锌的物质的量比2∶1,用醋酸调控螯合体系pH为4,控制螯合温度为50℃,螯合时间分别为0.5、1.0、1.5、2.0 h,按1.2.2方法制备复合氨基酸螯合锌,考察螯合时间对螯合反应的影响,结果见表4。
表4 螯合时间对螯合反应的影响
由表4可知,当螯合时间为1 h时,复合氨基酸螯合锌中锌的螯合率最大,为80.86%。
2.2 正交实验
在单因素实验的基础上,以复合氨基酸标准品与氯化锌的物质的量比(A)、体系pH(B)、螯合温度(C)、螯合时间(D)为考察因素,以锌的螯合率为指标,进行四因素三水平正交实验,以确定最佳螯合工艺条件,正交实验因素水平见表5,正交实验设计及结果见表6。
表5 正交实验因素水平
表6 正交实验设计及结果
由表6可知,各因素对螯合反应影响的主次顺序为A>C>B>D,即复合氨基酸标准品与氯化锌的物质的量比影响最大,其次是螯合温度,体系pH影响次之,螯合时间影响最小。最优工艺组合为A2B3C1D1,即复合氨基酸标准品与氯化锌的物质的量比2∶1,体系pH 5,螯合温度40℃,螯合时间0.5 h。螯合温度过低,不利于螯合,但温度太高,氨基酸螯合物不稳定;螯合时间太短,螯合率低,螯合时间太长,产物复杂;体系pH太低,不利于螯合,体系pH太高,金属盐水解,不利于螯合;复合氨基酸与氯化锌的物质的量比为2∶1时,原料尽可能用完,不会浪费。
以花生粕为原料制备复合氨基酸,在最佳螯合工艺即螯合温度40℃、螯合时间0.5 h、体系pH 5、复合氨基酸与氯化锌的物质的量比2∶1条件下,制备复合氨基酸螯合锌,测定其IR图谱进行表征,用EDTA法测定复合氨基酸螯合锌中的锌含量,以进一步确定目标。
2.3 IR表征
2.3.1 复合氨基酸的IR图谱
按1.2.4方法测绘的复合氨基酸标准品、自制复合氨基酸的IR图谱以及解成骏等[6]测绘的复合氨基酸IR图谱,见图1。
图1 复合氨基酸标准品(1)、自制复合氨基酸(2)、文献[6](3)的复合氨基酸IR图谱
2.3.2 制备的复合氨基酸和复合氨基酸螯合锌的IR图谱(见图2)
由图2可知,伸缩振动区的复合氨基酸在3 371.57 cm-1处有N—H键的特征吸收峰,而复合氨基酸与锌螯合后N—H键吸收峰出现在3 151.80 cm-1处,螯合物中明显发生了化学反应而产生吸收峰红移,复合氨基酸在2 988.87 cm-1处出现较强的O—H键吸收峰,在3 057.81 cm-1处有C—H键吸收峰。复合氨基酸与锌螯合后无O—H键吸收峰,C—H键吸收峰出现在2 962.86 cm-1处。复合氨基酸中N—H、C—H、O—H键的特征吸收峰比较明显,而复合氨基酸螯合锌的红外光谱中N—H键比较明显、C—H键峰减弱、无O—H键的吸收峰,故判断复合氨基酸已经与锌离子螯合。
图2 自制复合氨基酸(1)、复合氨基酸螯合锌(2)的IR图谱
2.4 复合氨基酸螯合锌中锌含量(见表7)
表7 螯合物中锌含量测定结果
由表7可知,螯合物中锌含量的平均值为29.34%,由于铜离子与锌离子的摩尔质量分别为63.55 g/mol和65.41 g/mol,解成骏等[6]在研究大豆粕制备复合氨基酸螯合铜的研究中,铜含量平均值为29.97%(误差在容量分析范围之内) ,两者相似,产品可信。
由于复合氨基酸的粒径与锌盐有固定的值,因而螯合是固定的,螯合物中的锌含量是固定的[5],因而测定产品中锌含量,复合氨基酸的含量也就可以算出,从而可对生产进行控制。
3 结 论
以花生粕为原料,通过特定温度下酸水解、活性炭脱色、有机试剂纯化制备复合氨基酸,然后与氯化锌螯合制备复合氨基酸螯合锌,对产品进行IR表征,用EDTA法测定金属锌含量,进一步确定目标产物。在生产实际控制过程中,先对产品进行IR表征,再用EDTA法测定金属锌含量,计算复合氨基酸的含量或用化学法测定氨基酸的含量,实现生产控制。
该工艺易操作、成本低,制得的产品纯度较高,螯合物的结构稳定,分析测试、生产控制简便易行。制备的产品经进一步纯化,可广泛应用于食品、饲料、农药等行业。该方法可供富含蛋白质的原料综合开发参考。