鲐鱼暗色肉肽锌螯合物的制备及结构表征

王 晴，邵 珺，李勇勇，石 娟，周丽萍，李超群，娄永江*

（1.宁波大学 食品与药学学院，浙江 宁波315211；2.宁波南衡进出口有限公司，浙江 宁波315000）

鲐鱼，俗称鲐巴鱼、青花鱼，为中上层鱼类。目前鲐鱼主要被加工成罐头食品[1]，加工过程有10%左右暗色肉被剔除。鲐鱼暗色肉营养丰富[2-4]，是优质蛋白质资源[5]，但目前鲐鱼暗色肉资源仅作为饲料鱼粉的加工原料，几乎无高值化利用。以鲐鱼暗色肉为原料制备了相对分子质量小于3 000的鲐鱼暗色肉蛋白肽，为研究提了充足的原料。

锌是人体必需的微量金属元素，在人体生长发育、生殖遗传、维持上皮细胞正常形态[6]、蛋白质合成及代谢等方面有至关重要的作用。锌缺乏会导致生殖功能障碍、性成熟延迟[7]、异食癖，并会影响神经、精神、味觉、血糖等方面，且与缺铁性贫血、原发性高血压、动脉粥样硬化、消化性溃疡、神经性耳聋等都有着密切关系[8]。从饮食中摄入的锌元素容易与植酸形成不溶性络合物，从而导致锌的生物利用度降低[9]。我国不同年龄组居民锌缺乏情况较为普遍，尤其是儿童、孕妇。因此必须采用有针对性的方法来改善锌缺乏。而小分子寡肽与微量元素螯合可提高机体对微量元素的吸收利用率且无副作用[10]。赵洪雷等[11]以小鼠为实验材料，研究出鲢鱼蛋白螯合锌有生物活性且能促进机体吸收；顾冰飞等[12]以杏鲍菇为原料，通过水提法提取杏鲍菇多糖，研究了杏鲍菇多糖锌螯合物的制备工艺并发现其抗氧化性。

螯合反应有反应温度高、周期长等缺点，而用超声螯合能有效提高化学反应速率，缩短反应时间，同时超声技术已在食品工业领域被广泛研究[13]。相对分子质量小于3 000的蛋白肽具有小分子寡肽的特性：胶原蛋白活性较强，好吸收且酶解产物中有最丰富的相对分子质量小于3 000的组分，生产成本较低。因此本研究以相对分子质量小于3 000的鲐鱼暗色肉蛋白肽为原料，通过超声法制备肽锌螯合物，以期获得同时具有锌和寡肽双重功能的新产品，促进水产品深加工业的发展。

1 材料与方法

1.1 试验材料及试剂

蛋白质质量分数为99%的鲐鱼暗色肉小分子寡肽粉末（相对分子质量小于3 000）、硫酸锌、EDTA、HCl、NaOH、铬黑T、NH3-NH4Cl缓冲溶液：均购于阿拉丁试剂公司（上海）。

1.2 试验仪器

Biosafer SB-4200DTS超声槽：购自南京赛飞生物科技有限公司；3H16RH智能高速冷冻离心机：购自湖南赫西仪器装备有限公司；Spectramax i3x酶标仪：购自美谷分子仪器（上海）有限公司；X射线能谱仪（EDS）：购自日本电子株式会社；日立L-8900全自动氨基酸分析仪：购自沈阳奇特尔科技有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 小分子寡肽与硫酸锌的超声螯合反应

1）螯合工艺鲐鱼暗色肉小分子寡肽（相对分子质量小于3 000）→温水溶解→加硫酸锌溶液→调pH→调超声温度→超声螯合反应→浓缩→乙醇析出→离心→干燥→肽锌螯合物

2）螯合得率测定取冻干后的肽粉，加去离子水充分溶解，分别用少量蒸馏水溶解，配制质量浓度为5 mg/mL的肽溶液，按一定体积比加入质量浓度为5 mg/mL的硫酸锌溶液，调pH后，开始在一定温度下进行一定时间的螯合，待反应完毕，进行冷却，加入8倍体积的无水乙醇，在4 500 r/min的转速下离心10 min，除去上清液，并用无水乙醇洗涤离心1～2次。将沉淀物置于45℃电热鼓风干燥箱中烘干，得肽锌螯合物，测定其螯合物得率。

式（1）中：W1为初始反应物的总质量，g；W2为反应后肽锌螯合物的总质量，g。

3）螯合率测定采用EDTA滴定法[14]。称量每份肽锌复合物，加入10 mL NH3-NH4Cl缓冲溶液溶解，再滴2滴铬黑T指示剂，用浓度为0.01 mol/L的乙二胺四乙酸二钠滴定，当溶液由紫色变为淡蓝色时停止滴定，记录消耗乙二胺四乙酸二钠的体积，按式（2）、（3）计算锌的螯合率。

式（2）中：X为肽锌复合物质量分数，%；M为锌的摩尔质量，g/mol；C为乙二胺四乙酸二钠的摩尔浓度，mol/L；V为滴定乙二胺四乙酸二钠的体积，L；m为称取肽锌复合物的质量，g。

1) 零点验证。仪表零点值是影响计量准确性的重要指标，该系统提供仪表零点核查功能，可实时获取到测量管振动频率、左检测线圈电压、右检测线圈电压、驱动增益、活零点等信息，开展零点验证核查。活零点是在一定时间范围内用平均值和流量计的零点稳定性指标进行比较，如果零点核查通过，说明目前是一个好的零点，不需要标定零点；如果零点核查通不过，需要标定零点。

式（3）中：Y为锌的螯合率，%；X为肽锌复合物的质量分数，%；m为肽锌复合物的质量，g；n为锌的投入量，g。

式（4）中：W3为螯合物中锌的质量，mg；W4为初始反应体系的锌及寡肽的质量，mg。

4）超声螯合反应的单因素试验主要将鲐鱼暗色肉小分子寡肽与硫酸锌在一定的螯合肽质量分数、时间、温度、pH、肽与硫酸锌质量比水平下，以螯合率、螯合得率为指标，在超声功率为250 W，频率为40 000 Hz的超声槽内进行螯合[15]。

5）超声螯合反应的响应面优化试验在单因素试验的基础上，选取时间、温度、pH、肽质量分数为试验因素，以螯合物得率、螯合率为评价指标，采用Box-Behnken方法设计四因素三水平响应面试验，试验设计因素与水平见表1。

表1 Box-Behnken试验设计因素与水平Table 1 Design factors and levels of Box-Behnken experiment

1.3.2 能谱分析 用双面胶将肽与肽锌螯合物粉末分别粘贴于铝制样品台上，然后获取检测微区，用EDX仪测定微区主要元素的质量分数和原子数百分含量，重复3次。EDX仪技术指标：电压10 000 V，电子束6.0 eV，工作距离10.0 mm[16]。

1.3.3 氨基酸成分分析 取适量鲐鱼暗色肉酶解液冷冻干燥产品及鲐鱼暗色肉肽锌螯合物，加入摩尔浓度为6 mol/L的HCl，充氮气后，热融密封，110℃烘箱中水解24 h，脱酸后用水定容至适宜浓度，上样，用L-8900全自动氨基酸分析仪测定[17]。

1.4 数据处理

实验平行3次，使用Origin8.0及SPSS软件进行数据处理。

2 结果与分析

2.1 鲐鱼暗色肉锌螯合物制备的单因素试验

2.1.1 螯合pH值对寡肽锌螯合得率及螯合率的影响由图1可知，螯合反应开始，随着pH的不断增加，肽锌螯合能力逐渐增强，在pH值为8时，其螯合能力达最大值，其螯合得率和螯合率达到最高值分别为53.32%、63.35%，随后缓慢下降。这是因为:氢离子与金属离子为竞争关系，体系中的氢离子解离较多，寡肽解离的氢离子较少，能与金属阳离子结合的位点就少，螯合率低。随pH加大，酸性减弱，体系中寡肽解离产生的氢离子增加，螯合率上升，当pH继续加大，碱性提高，氢氧根离子增多，就产生了氢氧化锌沉淀，螯合率下降[18-21]。

图1 pH对螯合能力的影响Fig.1 Effect of pH on the chelating ability

2.1.2 螯合时间对寡肽锌螯合得率及螯合率的影响从图2可知，随着螯合时间增长，肽锌螯合能力有所提高（P＜0.05），当反应时间达到50 min左右时，肽锌螯合能力达最大值，随着反应时间继续延长，其螯合得率基本稳定（P＞0.05）。主要是因为：随着时间延长，螯合反应基本达到平衡，螯合得率基本保持稳定，但是随着时间延长，体系的稳定性被破坏，其副反应的发生率提高，导致部分配合物开始解离，螯合率下降[22]。

图2 螯合时间对螯合能力的影响Fig.2 Effect of chelating time on chelating ability

2.1.3 螯合肽质量分数对寡肽锌螯合得率及螯合率的影响 由图3可知，肽质量分数为5%时，螯合得率及螯合率达最大值，之后趋于稳定（P＞0.05）。主要是因为：肽与锌浓度低，由热运动引起的螯合碰撞少，随着肽质量分数增加，蛋白肽分子与锌离子分布密集，碰撞概率提升，从而减弱螯合效果。

图3 肽质量分数对螯合能力的影响Fig.3 Effect of peptide concentration on chelating ability

2.1.4 螯合温度对寡肽锌螯合得率及螯合率的影响由图4可知，螯合能力随着反应温度的上升出现先升高后下降的趋势，在反应温度达到70℃时，其螯合能力达到最大，随后开始下降（P＜0.05）。这是因为：溶液中的锌离子会随着温度升高而加速溶出，这增大了锌离子与肽的碰撞频率[23]，有利于螯合反应的进行，但高温易破坏肽类结构[24-25]，使反应活性位点不易暴露，寡肽锌的结合位点减少，不利于螯合能力提升。

图4 温度对螯合能力的影响Fig.4 Effect of temperature on the chelating ability

2.1.5 硫酸锌与肽质量比对寡肽锌螯合得率及螯合率的影响 由图5可知，硫酸锌与肽的质量比为2∶1时，螯合效果最佳。原因是：当硫酸锌与肽的质量比过小时，寡肽团聚暴露点减少，肽的有效利用率下降，过量的寡肽不利于螯合反应的发生，还会造成资源浪费；当硫酸锌与肽的质量比过大时，锌离子浓度占优势，有较强的争夺供电基团能力，而溶液中的寡肽无法生成稳定的环状结构且肽浓度低，大量的锌离子未参与螯合反应[26]，螯合效果下降，故曲线呈现先逐渐上升后下降的趋势。

图5 硫酸锌与肽质量比对螯合能力的影响Fig.5 Effect of the mass ratio of zinc sulfate to peptide on the chelating ability

2.2 响应面试验结果

2.2.1 响应试验模型的建立与试验结果分析 利用Design-Expert 8.0.6软件对表2中的数据进行多元回归拟合，得到的螯合得率（%）、螯合率（%）对时间A（min）、温度B（℃）、pHC、肽质量分数D（%）的四元二次回归方程分别为：Y螯合得率=56.20-1.75A-1.50B+2.75C+1.67D-0.25AB+3.75AC-2.75AD+1.00BC+3.25BD+2.00CD-4.47A2-3.60B2-4.73C2-4.10D2；Y螯合率=65.40-0.50A-0.42B+2.17C+2.25D+1.25AB+1.5AC-3.25AD+1.50BC+4.00BD-2.00CD-5.62A2-3.49B2-4.37C2-3.47D2。

由表3和表4可知，对该回归方程进行方差分析，模型项达到极显著（P＜0.01），失拟项不显著（P＞0.05），说明该模型构建成功。螯合得率模型的决定系数R2=0.836 5，螯合率模型的决定系数为R2=0.824 1，这证明响应面回归模型与实际试验拟合度较高，模型的精密度较高，可用此回归方程对螯合得率和螯合率进行理论预测。表3中4个试验因素对螯合得率的影响从小到大依次为：温度（B）、肽质量分数（D）、时间（A）、pH（C）。一次项C和二次项A2、B2、C2、D2对螯合得率的影响极显著（P＜0.01）；交互项AC、BD对螯合得率的影响显著（P＜0.05），其余项对指标影响不显著。表4中4个试验因素对螯合率的影响从小到大依次为：温度（B）、时间（A）、pH（C）、肽质量分数（D）。二次项A2、C2对螯合率的影响极显著（P＜0.01）；一次项C、D、交互项AD、BD及二次项B2、D2对螯合率的影响显著（P＜0.05），其余项对指标影响不显著。

表2 Box－Behnken试验设计及响应值Table 2 Box-Behnken test design and response value

表3 螯合得率回归模型方差分析Table 3 ANOVA of chelation yield regression model

2.2.2 响应面分析 响应面交互作用分析通过响应面图和等高线图可以直观反映研究因素及其交互作用对螯合得率及螯合率的影响，响应面图6、7、8、9、10、11中曲线越弯曲说明对研究因素影响越大，等高线呈椭圆形说明试验因素之间的交互作用显著，等高线呈圆形说明试验因素之间的交互作用不显著。从等高线形状看，pH值和温度沿着弯曲表面上升的斜率陡峭，并且轴向轮廓致密，故反应pH值和反应温度存在显著的交互作用，且明显可以看出反应pH值对肽锌螯合能力的影响相比温度较大。可能是因为随着温度升高，分子运动活跃，碰撞机会多，且相互之间团聚的可能性变大，螯合物就会絮凝下来。pH值较低时，溶液中的H+较多，易于与寡肽中的羧基或氨基结合；值较高时，容易形成氢氧化锌溶液中的Zn2+减少，也不利于胶原寡肽螯合锌的生成。

根据Design Expert试验设计软件分析得到佳螯合条件为肽锌质量比为1∶2、反应温度72.37℃、反应pH 7.85、肽质量分数5.35%、反应时间51.33 min，此时得到的响应预测螯合得率与螯合率分别56.98%、66.00%。

2.2.3 验证试验 结合实验的可行性，验证试验采取的工艺条件适当调整为：螯合时间51min、螯合温度72℃、肽锌质量比1∶2、肽质量分数5.35%、螯合pH值7.9，在该工艺条件下测得肽锌螯合得率与螯合率分别为55.86%、65.12%，与预测值相比，误差较小，说明该模型可行。

表4 螯合率回归模型方差分析Table 4 ANOVA of chelation rate regression model

2.3 氨基酸成分分析

图6 时间和pH的交互作用对螯合率和螯合得率的响应面Fig.6 Response surface diagram of the interaction between time and pH on chelation rate and chelation yield

图7 温度和pH的交互作用对螯合率和螯合得率的响应面Fig.7 Response surface diagram of the interaction between temperature and pH on chelation rate and chelation yield

图8 肽质量分数和p H的交互作用对螯合率和螯合得率的响应面Fig.8 Response surface diagram of the interaction between peptide concentration and pH on chelation rate and chelation yield

图9 时间和温度的交互作用对螯合率和螯合得率的响应面Fig.9 Response surface diagram of the interaction between time and temperature on chelation rate and chelation yield

图10 时间和肽质量分数的交互作用对螯合率和螯合得率的响应面Fig.10 Response surface diagram of the interaction between time and peptide concentration on chelation rate and chelation yield

图11 温度和肽质量分数的交互作用对螯合率和螯合得率的响应面Fig.11 Response surface diagram of the interaction between temperature and peptide concentration on chelation rate and chelation yield

由表5可知，鲐鱼暗色肉蛋白寡肽与鲐鱼暗色肉肽锌螯合物共检出17种氨基酸，与鲜味氨基酸有关的氨基酸如谷氨酸、天门冬氨酸，这两者的质量分数均较高。其中呈中性、碱性的氨基酸两者均占了较大的比例。但各种氨基酸的质量分数有所变化。此外，构成胶原蛋白的脯氨酸、甘氨酸、谷氨酸和精氨酸的质量分数之和在鲐鱼暗色肉蛋白寡肽与其肽锌螯合物中分别为43.78%和35.35%。研究表明，肽的氨基酸组成、羧基和酸性氨基酸的侧链氨基与肽的金属离子螯合能力有关且赖氨酸（Lys）、组氨酸（His）、脯氨酸（Pro）等有较高的金属螯合活性[15]，尤其是金属离子Cu2+、Zn2+、Ni2+等易与肽或蛋白质表面的组氨酸咪唑基结合，且组氨酸残基越多，肽的锌螯合率越大[27]。

表5 氨基酸成分分析Table 5 Amino acid composition analysis

2.4 能谱分析

对制备的样品用能谱仪进行面扫描，见图12。由表6可知，鲐鱼暗色肉寡肽无Zn原子，肽锌螯合物中Zn原子数百分含量为15.59%，Zn质量分数增至44.94%。C的原子数百分含量和质量分数分别从67.82%、60.14%降至40.48%、21.44%，O的原子数百分含量由28.6%提升至40.21%，而O的质量分数从33.78%下降至28.37%。此外肽锌螯合物中多了S元素，这可能是因为寡肽在螯合过程中，添加了硫酸锌，继而导致螯合物中有硫酸根离子的残留。肽锌螯合物酶解液寡肽能谱图中，没有Zn峰，而肽锌螯合物能谱图（b）中有3个Zn峰，这说明Zn2+与寡肽在3个位点发生了螯合，能谱分析结果表明：大量Zn2+与鲐鱼暗色肉寡肽发生了螯合。

图12 鲐鱼暗色肉蛋白肽及肽锌螯合物的能谱分析Fig.12 Energy spectrum analysis diagram of mackerel dark meat protein peptide and peptide zinc chelate

表6 鲐鱼暗色肉蛋白肽及肽锌螯合物的能谱分析结果Table 6 Energy spectrum analysis results of mackerel dark-colored meat protein peptide and peptide zinc chelate

3 结 语

本研究将酶解后的鲐鱼暗色肉与锌离子进行螯合，以螯合得率和螯合率为指标，考察反应时间、温度、pH、肽质量分数、硫酸锌与肽的质量比对螯合能力的影响。通过响应面结合实际应用得出最佳工艺条件为螯合时间51 min、螯合温度72℃、肽锌质量比1∶2、肽质量分数5.35%、螯合pH值7.9，螯合得率与螯合率分别为55.86%、65.12%，这为鲐鱼暗色肉肽锌螯合物制备提供了较为理想的工艺模型。对鲐鱼暗色肉肽锌螯合物进行氨基酸、能谱分析，结果表明肽与锌结合后，形成了含锌量较高的物质，为鲐鱼暗色肉的高值化利用提供了依据。