1株猪传染性胸膜肺炎放线杆菌的分离鉴定、毒素基因检测、分型及药敏试验

刘 洋 ， 龙 剑 ， 梁 娅 ， 廖华媛 ， 李润成

(湖南农业大学动物医学院 ， 湖南 长沙 410128)

猪传染性胸膜肺炎(Porcine contagious pleuropneumonia, PCP)是一种由猪传染性胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacilluspleuropneumoniae, APP)引起的烈性传染性呼吸道疾病，其死亡率极高，主要临床症状表现为出血性纤维素性肺炎和坏死性纤维素性肺炎[1]。随着我国集约化养猪业的急速发展以及区域之间的频繁引种，该病在我国的流行趋势日渐上升，现已成为我国猪群主要的细菌性呼吸道传染病之一，给我国的养猪业造成了巨大的经济损失。

APP有2种分型方式，第1种以其生长时是否依赖烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(Nicotinamide adenine dinucleotide，NAD)为条件分为生物Ⅰ型和生物Ⅱ型，其中生物Ⅰ型生长需要NAD，生物Ⅱ型生长不依赖NAD[2]。根据APP脂多糖(Lipopolysaccharides，LPS)和荚膜多糖(Capsular polysaccharide，CPS)的差异又可以将其分为18种血清型，其中血清型16型、17型和18型在2015-2018年才被发现[3-7]。

传染性胸膜肺炎放线杆菌的侵袭力和持久性与众多毒力因子相关，Apx毒素是其主要的毒力因子之一。Apx毒素包括Apx I、Apx II、Apx III和Apx IV，其中Apx I具有很强的溶血性和细胞毒性，其能诱导猪的肺泡巨噬细胞发生细胞凋亡；Apx II的溶血性和细胞毒性相对较弱；Apx III无溶血性但具有很强的细胞毒性，其能对外周单核细胞造成巨大的损伤；Apx IV虽然毒性较小，但APP的所有血清型都含有该基因，可以将其视为鉴定APP菌株的特异性基因[2,8-9]。

2018年12月，浙江慈溪某规模化猪场部分肥猪出现体温升高、呼吸困难、咳嗽等症状，对死亡猪只进行剖检，其主要病理变化为纤维素性肺炎、心包炎和胸腔积液，见封三彩版图1、2，疑似APP感染。取病死猪的肺脏进行了细菌分离鉴定、毒力基因检测、血清型鉴定、生物型鉴定及药敏试验，报告如下。

1 材料

1.1 病料 2018年12月，病料采集于浙江慈溪某规模化猪场病死猪的肺脏。

1.2 培养基 TSB培养基，购自OXOID公司；巧克力平板，购自贝瑞特公司；血琼脂平板，购自江门公司。

1.3 试剂 小牛血清，购自益康生物公司；革兰染色试剂及烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)，均购自北京索莱宝科技有限公司；即用型PCR试剂盒3.0(Mix)，购自北京天恩泽生物技术有限公司；2 000 DNA Marker及Super DNA Marker，均购自北京康为世纪公司；药敏纸片，购自杭州微生物试剂有限公司。

2 方法

2.1 细菌分离及革兰染色镜检 用无菌接种环钩取病死猪的肺脏接种于巧克力平板上，将巧克力平板置于37 ℃温箱中培养24 h，次日观察菌落的大小及形态，从中挑取单菌落纯化并进行革兰染色镜检。

2.2 16S rDNA PCR检测 参照文献[10]中的方法合成细菌16S rDNA通用引物。以分离菌株为模板，用16S rDNA通用引物进行PCR扩增。PCR程序：预变性94 ℃ 5 min; 变性94 ℃ 30 s，退火58 ℃ 30 s，延伸72 ℃ 30 s，30个循环; 再延伸72 ℃ 7 min。PCR体系：Mix 25 μL，纯水22 μL，上游引物1 μL，下游引物1 μL,模板1 μL。将PCR产物送至擎科生物技术有限公司进行测序并对测序结果进行分析。

2.3Apx毒素的鉴定 按照廖华媛等[11]的方法合成Apx毒素基因检测引物。以分离菌株为模板，用4对毒素基因检测引物进行PCR扩增。PCR程序：预变性94 ℃ 5 min；变性94 ℃ 30 s，ApxI退火65 ℃，ApxII退火63 ℃，ApxIII及ApxIV退火61 ℃ 30 s；延伸72 ℃ 30 s，30个循环；再延伸72 ℃ 7 min。PCR体系：Mix 25 μL，纯水22 μL，上游引物1 μL，下游引物1 μL，模板1 μL。

2.4 血清型及生物型分型 将分离菌株接种于涂有NAD的血琼脂平板及未涂NAD的血琼脂平板上，置于37 ℃温箱中培养24 h，次日观察细菌是否生长，若分离菌株的生长需要依赖NAD，则说明其为生物Ⅰ型，若分离菌株的生长不依赖NAD，则说明其为生物Ⅱ型[2]。按照Bossé等[12]的方法合成血清型鉴定引物，对该菌株进行血清型鉴定，PCR方法按常规进行。

2.5 药敏试验 使用K-B法对分离菌株进行药敏试验。将分离菌株接种至含10%小牛血清及1‰NAD的TSB培养基中，于37 ℃，180 r/min摇床中培养12 h。将培养好的细菌用无菌水稀释至0.5麦氏单位浓度，吸取100 μL稀释菌液用涂布器均匀涂于巧克力平板上，待液体吸干后将药敏试纸片轻轻贴在巧克力平板上，于37 ℃温箱培养24 h，次日记录抑菌环的直径并根据其结果判断分离菌株对不同药物的敏感程度。

3 结果

3.1 细菌分离 用无菌接种环钩取病死猪的肺脏接种于含NAD的巧克力平板上，并从中挑取单菌落进行纯化。在巧克力平板中长出了直径为1～3 mm、圆形、隆起、表面光滑、边缘整齐的灰白半透明菌落。见封三彩版图3。

3.2 革兰染色镜检 从纯化过的巧克力平板中挑取单菌落进行革兰染色镜检，在显微镜中看到了大量革兰阴性杆菌，多散发呈杆状，也有短链状。其大小和形态与传染性胸膜肺炎放线杆菌极其相似，革兰染色镜检见封三彩版图4。

3.3 16S rDNA PCR检测 以分离菌株为模板，用细菌16S rDNA通用引物进行PCR扩增，结果扩增到了与预期大小相符的特异性条带，见图5。将PCR产物送至长沙擎科生物技术有限公司测序，测序结果与GenBank中已发表的APP基因序列的同源性为99%，确定该分离菌株为APP。

图5 16S rDNA PCR结果

3.4Apx毒素的鉴定结果 对分离菌株进行Apx4种毒素的PCR鉴定，鉴定结果显示该菌株含有ApxII(358 bp)、ApxIII(320 bp)、ApxIV(634 bp)3种毒素基因。DNA电泳图见图6。

图6 Apx毒素基因鉴定结果

3.5 生物型及血清型鉴定 将分离菌株涂板于含NAD的血琼脂平板及不含NAD的血琼脂平板上，置于37 ℃温箱中培养24 h，次日发现含NAD的血琼脂平板上有菌落生长且伴随有溶血现象，而不含NAD的血琼脂平板上无菌落生长，说明分离菌株在生长过程中需要依赖NAD，其属于生物Ⅰ型。据文献报道[8,13-14]，能同时产生Apx II、Apx III、Apx IV 3种毒素的APP血清型只有2、3、4、6、8型及15型，参照文献[12]合成了2、3、4、6、8型及15型血清型鉴定引物并对分离菌株进行了血清型鉴定，结果显示，该菌株为APP 15型菌株。将PCR产物送至长沙擎科生物技术有限公司进行测序，对测序结果进行BLAST比对，结果显示该序列与GenBank中APP 15型基因序列的同源性为99%，确定分离菌株的血清型为15型。APP 2、3、4、6、8、15型血清型PCR鉴定结果见图7。

图7 APP 2、3、4、6、8、15型血清型鉴定结果

3.6 药敏试验 药敏试验结果显示，分离菌株对头孢曲松、恩诺沙星、氨苄西林及复方新诺明4种药物较为敏感，对链霉素有较强的耐药性。见表1。

表1 分离菌株部分药敏试验结果

4 讨论

本试验从浙江慈溪某猪场病死猪的肺脏中分离到了1株细菌，其形态大小与APP相似，经16S rDNA PCR鉴定后，确定该菌株为APP菌株。后对其进行了4种Apx毒素基因的检测，发现该菌株同时含有ApxII、ApxIII和ApxIV 3种毒素基因。查阅文献发现同时含有ApxII、ApxIII和ApxIV毒素基因的APP血清型可能为2、3、4、6、8型或者15型，利用上述6种血清型的鉴定引物对分离菌株进行了PCR鉴定，最终确定其为APP 15型菌株。在培养细菌的过程中，发现该菌株需要依赖NAD才能生长，根据这一特性，最终确定其为生物Ⅰ型APP菌株。用12种常用抗生素对其进行了药敏试验，结果显示，分离菌株对头孢曲松、恩诺沙星、氨苄西林及复方新诺明4种药物较为敏感，对链霉素具有较强的耐药性。

猪传染性胸膜肺炎的病理变化主要表现为肺部出血、坏死性支气管肺炎、纤维素性胸膜炎和胸腔积液等，具有较高的致死性，近年来，此病在我国多处地方暴发，给我国畜牧业带来了严重的经济损失。因此PCP的防控显得十分重要，现今疫苗防控和药物防控是预防PCP的主要途径。目前国内市场上针对PCP的疫苗主要为灭活疫苗，PCP灭活疫苗在临床上的应用并不普遍， 即使PCP发病严重的猪场对疫苗的选择也多举棋不定，再加上临床生产实践中抗生素的滥用，APP的耐药性问题也越来越严重，这给本病的防控增加了难度。广大的养殖户可以了解当地菌株的流行情况及血清型，从而制备合适的血清型疫苗进行免疫接种，并且将当地流行株的耐药情况了解清楚，选择合适的药物防治该病。