氟苯尼考的应用及其毒副作用

胡东方 ， 孟凡亮 ， 银 梅 ， 葛亚明 ， 刘思当

(1.河南科技学院动物科技学院 ， 河南 新乡 453003 ； 2.山东农业大学动物科技学院 ， 山东 泰安 271018)

氟苯尼考(Florfenicol，FLO)又称氟甲砜霉素，是氯霉素类的第3代广谱抗菌药物。该药最初上市时主要用于水产养殖业细菌性疾病的防控；随后，FLO迅速在多个国家被批准应用于鱼类疾病、牛呼吸系统细菌性疾病等的防治；在有些国家也被准许添加在畜禽日粮中，以达到提高饲料转化率及促生长等作用[1-2]。作为新一代动物专用的广谱抗菌药，FLO具有抗菌谱广、吸收好、体内分布广、安全高效等特点，我国在2000年就通过了FLO作为二类新兽药的审批。近10多年来，FLO被越来越多的应用到我国兽医临床和水产养殖业，生产企业和产量也在不断增加。据统计，截至2017年底，我国共有FLO兽药生产批准文号6 600余个，生产企业几千家，且目前全国FLO原料药的销售量已达1 000余吨，表明FLO在我国畜禽及水产动物细菌性疾病防控过程中发挥着举足轻重的作用[3]。

1 抗菌机理

由于氯霉素会导致机体发生严重的不良反应，如再生障碍性贫血，目前在全球范围内该药在食品动物生产中已被禁止使用。以甲磺酰基(CH3SO2-)取代芳香环上的对位硝基(-NO2)而合成的甲砜霉素，便有效消除了氯霉素致再生障碍性贫血的风险；而进一步将甲砜霉素分子中C3的羟基(-OH)用氟原子(-F)取代生成FLO(图1)后发现，该举措可有效降低细菌乙酰转移酶对此位置的乙酰化作用，从而降低了药物被细菌酶降解的程度，增强了药物对氯霉素及甲砜霉素耐药菌株的抗菌活性[4]。

图1 3种氯霉素类药物的分子结构

FLO属于一种抑制细菌蛋白质合成的药物，可以显著抑制革兰阳性菌和阴性菌，与氯霉素及甲砜霉素的抗菌机制相近。FLO进入细菌菌体后可以和细菌核糖体50S大亚基上的A位点紧密结合，从而影响肽链延长过程中肽酰转移酶的转肽反应，使肽链的延长终止，最终起到抑制细菌蛋白质生成和抗菌的目的[2]。并且由于FLO分子中的α-OH被取代，使得FLO对细菌耐药酶的耐受性大幅提高，所以该药对氯霉素和甲砜霉素耐药的细菌也具有良好抗菌活性[4]。

2 临床应用

FLO起初被用于水产养殖业细菌性疾病的防控，对杀鱼巴斯德菌、迟钝爱德华菌、巴氏杆菌、金黄色葡萄球菌等绝大多数革兰阴性和阳性的鱼、虾、蟹、贝类致病菌呈高度抗菌活性[5]，且FLO对常见致病菌的体外最低抑菌浓度一般在0.3～1.6 μg/mL[6]。在畜禽疾病防控方面，FLO曾被广泛应用与猪、禽、牛、羊等动物的细菌性疾病防控。在猪病临床，FLO已被大量使用于由巴氏杆菌引起的猪肺疫、猪萎缩性鼻炎及胸膜肺炎放线杆菌等引起的呼吸系统疾病。在家禽方面，主要应用于大肠杆菌病及传染性浆膜炎等敏感菌所致疾病[1]。另外，FLO注射液也被用于治疗各种年龄牛的呼吸系统细菌性疾病及腐蹄病。总的来说，FLO与其他常用抗菌药物相比，对常见畜禽及水产动物致病菌有着较强的抗菌活性；同时，FLO对耐氯霉素和甲砜霉素的大肠杆菌、沙门菌及克雷伯菌等亦有良好抗菌作用。

近来研究表明，FLO除了具有抗菌作用外，还能够抑制多种炎症因子的产生并抑制机体的炎症反应。邓旭明教授团队研究发现，FLO能够通过抑制NF-κB通路而降低由细菌脂多糖诱导的RAW264.7细胞及小鼠血清中TNF和IL-6的水平，并显著提高内毒素血症小鼠的成活率[7-8]。此外，按照100 mg/(kg·bw)的剂量口服FLO后，对脂多糖诱导的急性肺损伤小鼠具有明显保护作用，主要表现在给药小鼠肺脏水肿的比例和程度均明显下降，且肺组织中及支气管灌洗液中炎性细胞浸润程度明显降低；FLO通过对Th2型细胞因子的产生及炎性细胞浸润程度的抑制，可显著改善由卵白蛋白诱导的哮喘小鼠的呼吸功能[9]。以上研究表明，FLO除可作为抗菌药用于细菌性疾病的治疗外，在败血性休克及呼吸系统炎症的防治方面也具有潜在的应用价值。

3 毒副作用

FLO与前两代药物相比，具有更高的药物安全性和抗菌效率，自上市之初至今，一直被作为兽医临床及水产养殖业中的明星药物，应用范围广、应用量大。但近年来关于FLO毒副作用的报道也越来越多，主要表现在以下几个方面。

3.1 免疫毒性 截至目前，FLO的诸多毒副作用中以免疫毒性的报道最多。最早关于FLO免疫毒性的报道可追溯至1987年，报道指出，与相同剂量的氯霉素相比，FLO可以显著抑制中性粒细胞对金黄色葡萄球菌的吞噬作用[2]。Khalifeh等(2009年)发现20 mg/(kg·bw)的FLO连用5 d可显著抑制鸡新城疫疫苗特异性抗体的生成，表明FLO抑制了肉鸡的体液免疫反应[10]。Chrzastek等(2011年)发现治疗剂量的FLO并未造成2日龄肉仔鸡法氏囊组织结构的显著变化，但是对法氏囊皮质和髓质中Bu-1+细胞的分布却产生了显著影响，表现在皮质中Bu-1+细胞比例升高和髓质中比例下降，流式细胞术检测结果表明，FLO处理组法氏囊Bu-1+细胞的数量下降了近9%，表明B细胞的成熟受到了FLO的抑制[11]。Guan等(2011年)在小鼠体内分别研究了FLO对口蹄疫疫苗及卵白蛋白免疫效果的影响，结果表明，FLO可显著抑制脾细胞的增殖活性，同时降低脾脏中CD19+B细胞的数目，高剂量时对CD3+T细胞的数目也产生明显影响；此外，FLO显著抑制了口蹄疫病毒及卵白蛋白的特异性抗体如IgG、IgG1和IgG2b的产生，表明FLO对小鼠的体液免疫水平和细胞免疫水平都有抑制作用[12]。而Lunden等(2000年)在研究抗生素对虹鳟鱼的免疫毒性时发现，治疗剂量的FLO连续处理10 d后，可以显著降低虹鳟鱼头肾淋巴细胞的增殖活性，且虹鳟鱼T细胞比B细胞更易受到FLO的影响[13]。Lis等(2011年)研究发现，FLO可显著降低小鼠外周血中白细胞、中性粒细胞及单核细胞的数量，同时抑制由SRBC免疫小鼠的体液免疫应答能力[14]。我们前期研究发现，保育猪在免疫猪瘟病毒疫苗后按照50 mg/(kg·bw)的剂量连用7 d FLO，可导致脾脏及胸腺发生明显的结构损伤，主要表现在脾脏白髓和胸腺皮质区结构疏松、淋巴细胞数量下降，同时，猪瘟疫苗特异性抗体水平也受到了影响，但是在停药后2周左右即可恢复正常，表明FLO可导致保育猪发生暂时性的免疫器官结构损伤和体液免疫抑制[15]。我们也在小鼠上对3种氯霉素类药物的免疫毒性进行了比较病理学研究，结果表明，3种药物均可导致胸腺及脾脏发生萎缩和结构损伤，其中以FLO导致的损伤作用最为严重；此外，药物处理后脾细胞发生了细胞周期阻滞和增殖活性下降，细胞凋亡比例也明显升高[16]。总的来说，FLO可造成免疫器官损伤，对不同动物均呈现出不同程度的体液免疫和细胞免疫抑制作用，其中以体液免疫抑制为主，但具体机制尚不明确。

3.2 胚胎发育毒性 除免疫毒性外，FLO导致的另一严重毒副作用即胚胎发育毒性。报道指出，按照10 mg/(kg·bw)饮水给予蛋鸡FLO 5 d后发现，蛋鸡所产受精蛋的孵化率降低了80%，而且FLO对孵化率的影响一直持续到停药后1周左右[17]。Al-Shahrani等(2015年)进一步研究发现，使用90 mg/(kg·bw)的FLO连续饲喂公鸡或母鸡5 d后，给药鸡并未出现中毒症状；单独对公鸡饲喂FLO也不影响种蛋的孵化率，但是单独对母鸡饲喂后则可明显降低种蛋的孵化率，与未给药组相比降幅高达70%；在此过程中，鸡胚主要在发育早期发生死亡，并以入孵5 d内死亡为主；当停药4 d后，母鸡所产受精蛋的孵化率即恢复正常。结果表明，FLO对入孵早期的鸡胚具有胚胎发育毒性，而对采食FLO的公鸡或母鸡并无明显毒性效应[1]。此外，据Schering-Plough公司数据显示，给大鼠按照12 mg/(kg·bw·d)的剂量连续饲喂90 d FLO后发现，大鼠的附睾重量显著减轻，同时母鼠的泌乳性能受到影响，子代大鼠的成活率也明显降低；对妊娠6～15 d的孕小鼠灌胃给予400 mg/(kg·bw)的FLO可亦导致胚胎死亡[1]。而截至目前，FLO所致胚胎发育毒性的机制尚不明确。

3.3 其他毒副作用 FLO在水产养殖过程中也被作为最常用的抗菌药物之一，因此，众多学者也就FLO对水生动物的安全性进行了研究。Gaikowski等(2013年)研究发现，正常剂量或5倍剂量的FLO对罗非鱼并无致死性，但会导致饲料消耗降低及体重减轻，且会导致鱼鳃发生结构损伤和功能异常，肝内糖原型和脂类型肝细胞空泡增多，淋巴细胞减少及前肾细胞坏死增加等病变，表明FLO对罗非鱼具有非致死性的毒副作用[5]。Botelho等(2015年)以幼龄罗非鱼为对象研究了FLO的基因毒性，其结果表明，FLO可导致罗非鱼红细胞发生核异常，彗星实验结果显示FLO导致鱼红细胞发生了严重的DNA损伤，而具体机制尚不明确[18]。Ren等(2017年)以梭子蟹为对象研究了FLO的毒副作用，结果显示，FLO可显著抑制肝胰腺的抗氧化水平，FLO同时诱导了梭子蟹解毒基因及相应酶的高表达；高剂量的FLO导致生物分子发生氧化应激损伤[19]。

4 毒副作用机制

研究表明，古细菌在长期进化过程中与其寄生的宿主细胞达成了互利共生状态，最终演化成了线粒体[20]。线粒体大约含有1 500种蛋白质，其中线粒体基因组(mtDNA)编码了13种参与氧化磷酸化的酶类，其他大部分蛋白质由核基因组(nDNA)编码，并转运到线粒体。其中，mtDNA编码的蛋白质由线粒体核糖体翻译，而nDNA编码的蛋白质则由细胞质核糖体翻译。缘于线粒体核糖体与细菌核糖体在起源及结构上的相似性，故而许多靶向细菌线粒体的抗菌药物在发挥抗菌作用的同时便不可避免地抑制了真核细胞线粒体核糖体的翻译功能。正常情况下，这些nDNA编码的线粒体蛋白质和mtDNA编码的多肽/蛋白质进行同步的、配套的翻译后折叠、组装过程，进而形成线粒体呼吸链复合体。在此过程中，如果由nDNA和mtNDA编码的线粒体蛋白质发生比例失衡，造成线粒体呼吸链复合体不能正确组装，则会造成线粒体的蛋白毒性应激和代谢应激[21]。当线粒体受到如蛋白毒性、渗透性变化及氧化应激等的影响而发生线粒体应激反应时，细胞内多种由线粒体到细胞核的信号转导通路如线粒体生物合成、线粒体自噬及线粒体未折叠蛋白反应等能够活化以缓解线粒体应激并维持线粒体功能。而当这些通路发生慢性、持续性活化后，则会导致线粒体毒性及功能异常。而越来越多的研究证实，线粒体除了为细胞供能外，还参与诸如钙稳态、生热作用、类固醇生成、解毒作用、炎症反应、氧化应激及细胞死亡等诸多生命活动过程并发挥重要调节作用[22]，因此线粒体损伤在FLO诱导的机体毒副作用中应该发挥重要作用。目前已报道的可造成线粒体损伤并引发机体毒副作用的抗菌药物包括氨基糖苷类药物、四环素类药物、大环内酯类药物及氯霉素等[23-24]。我们前期在细胞水平研究了FLO对线粒体结构与功能的影响及线粒体损伤对细胞生命活动的影响，结果显示， FLO可造成线粒体结构和功能损伤，并通过活化能量应激蛋白AMPK，激活mTOR/p70S6K信号通路；同时p53/p21通路也被活化，导致了细胞周期发生G0/G1阻滞和增殖抑制。此外，功能异常的线粒体导致胞内活性氧(ROS)升高，ROS引起的p53表达上调抑制了线粒体自噬蛋白Parkin向损伤线粒体的转位过程，阻碍了线粒体自噬的进行，致使损伤线粒体在细胞内大量累积，进一步抑制了细胞增殖并诱发了细胞早衰[25]。尽管目前已经明确FLO对线粒体蛋白质合成及线粒体结构与功能的影响，但FLO造成机体毒副作用特别是免疫毒性和胚胎发育毒性的分子病理机制尚需深入研究。

5 展望

FLO作为目前兽医临床及水产养殖过程中适用范围最广、使用量最大的抗菌药之一，在使用时应严格控制使用的时间和剂量，不能滥用，更不能乱用；应注意药物的联合使用及合理配伍，尽可能做到科学合理用药并减少毒副作用及耐药性的发生。需特别注意的是，由于本品具有胚胎毒性，妊娠期及哺乳期家畜应慎用，家禽在产蛋期应禁用；且本品具有造血免疫毒性，虽然不会引起再生障碍性贫血，但其引起的可逆性红细胞生成抑制和免疫抑制作用比氯霉素更常见，疫苗接种期或免疫功能严重受损的动物宜禁用。此外，为进一步指导FLO的合理应用，并为新药研发提供依据，深入研究和阐明FLO毒副作用的机制，特别是FLO所致的免疫毒性和胚胎发育毒性，将成为药理学与毒理学领域新的课题。