噻拉嗪对大鼠离体脑神经元ATP酶活性影响的研究

2020-08-03杜雪曼连慧敏唐赛男刘文瀚赵菁华

中国兽医杂志 2020年1期

陈宇，杜雪曼，连慧敏，唐赛男，刘文瀚，赵菁华，高利

(东北农业大学动物医学学院黑龙江省实验动物与比较医学教育部重点实验室，黑龙江哈尔滨 150030)

ATP酶广泛分布于脑组织中，有学者认为其可调节多数细胞的活性。其中Na+-K+-ATP酶主要在调节神经元信号传导、离子稳态、肌肉收缩等方面发挥重要作用[1]；而细胞膜上Ca2+-Mg2+-ATP酶能使胞浆内Ca2+维持细胞稳态从而使神经系统功能正常。

噻拉嗪(Xylazine，2，6-二甲苯胺噻嗪)通过直接作用于α-2型肾上腺素能受体产生中枢抑制作用从而起到麻醉作用[2]。经过多年的临床应用发现，噻拉嗪使用后肌松效果良好，且在安全用药范围内，药物效果会随着剂量的增加而逐步加强。而噻拉嗪对Na+-K+-ATP酶和Ca2+-Mg2+-ATP酶活性变化的情况鲜有报道。因此，本试验通过噻拉嗪对离体神经元中Na+-K+-ATP酶和Ca2+-Mg2+-ATP酶活性的变化来探讨噻拉嗪麻醉机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物 Wistar大鼠30只，质量180～220 g；孕16～18 d的Wistar大鼠5只，质量230～270 g，哈尔滨医科大学附属第二医院动物实验中心提供。

1.2 主要药品与试剂噻拉嗪，由东北农业大学动物医学学院外科教研室提供；胎牛血清(FBS，16140071，Invitrogen)；青链霉素(15140122，Invitrogen)；胰酶(LS003707，Worthington)；Mouse anti-MAP2 antibody(13-1500)；PBS(pH值为7.4，10010-023，Gibco)；细胞裂解液(北京赛驰生物科技有限公司)；考马斯亮兰蛋白质含量测定试剂盒、超微量ATP酶测定试剂盒(南京建成生物工程研究所)；ProLong Gold antifade(P36934,Invitrogen)。

1.3 试验仪器 Waters 600高效液相色谱系统，色谱柱：Symmetry C18(4.6×150 mm，5 μm)；细胞培养箱(Thermo公司)；离心机、血细胞计数板(湖南星科科学仪器有限公司)；高速冷冻离心机(德国Sartorius公司)；75 μm细胞滤网(昆山市超声仪器有限公司)；手术器械，由东北农业大学外科教研室提供。

1.4 细胞培养及鉴定

1.4.1 神经元的培养培养板在紫外线下照射0.5 h。随后，培养板底部由足量聚左旋赖氨酸覆盖，混匀并放置过夜。将怀孕大鼠断颈处死，常规手术消毒，开腹，从子宫中取出胎鼠并断颈处死，将完整脑组织放入分离培养液中进行皮质的分离(分离过程中需确保脑组织完全浸在分离液中)。将组织剪碎(大小约为1 mm3)后置于15 mL离心管中，待所有组织沉底后弃去85%～90%液体，然后再加入10 mL新分离液。组织沉底后弃去分离液，重复2次。将组织悬浮在4.5 mL新分离液中，加入0.5 mL胰蛋白酶液，轻柔混匀。37 ℃水浴锅中消化5～10 min。加入接种培养基终止消化，用长枪头轻柔吹打10次后1 000 r/min离心5 min。吸净上清液后用2 mL接种培养基重悬细胞，洗涤2次。视消化组织黏稠程度加入0.1～0.5 mL的DNA酶，室温处理5 min。

用长枪头轻柔吹打组织8～10次，使细胞分散进而制得细胞悬液。将分散的细胞悬液用培养基进行10倍稀释。在细胞计数板上估算活性细胞的密度。根据细胞状态，在6孔板上加细胞，密度为105～106个/mL(须均匀接种到培养板上)。在细胞培养箱中37 ℃培养4 h后，从每个孔中吸出培养基，再向每个孔中加入2 mL 37 ℃维持培养基。随后，放在细胞培养箱里37 ℃，5%CO2培养。接种后2 d加入终浓度为1～5 μmol/L胞嘧啶阿糖核苷(阿糖胞苷；1-b-D阿糖呋喃胞嘧啶)来抑制非神经元增殖，1周2次，每次弃掉一半培养基，再加入相同体积新培养基。

1.4.2 神经元的鉴定将培养孔中培养液缓慢吸出，然后快速加入37 ℃多聚甲醛与蔗糖的混合液1 mL，置于室温10 min。多聚甲醛与蔗糖混合液吸出后，加入0.1%的TritonX-100 1 mL到培养孔中，室温放置10 min。PBS轻柔浸洗玻片后加5%牛血清白蛋白1 mL，置于室温1 h。在载玻片上滴加MAP-2后4 ℃过夜。用PBS浸洗载玻片3次，每次3 min，然后滴加二抗并室温放置1 h；再用PBS浸洗载玻片3次。在一侧滴入1滴抗褪色封固液(ProLong Gold antifade)，将含细胞一侧向下，清除多余封固液。载玻片避光放置1 h后置于显微镜下观察。

1.5 细胞给药浓度测定将30只Wistar大鼠随机分为3组：低剂量组(D组)，麻醉组(M组)，高剂量组(G组)。D组腹腔注射噻拉嗪10、20、30、40 mg/(kg·bw)，M组腹腔注射噻拉嗪50、60、70、80、90、100 mg/(kg·bw)，G组腹腔注射噻拉嗪150、200、300 mg/(kg·bw)，每个浓度3个平行，心脏采血，高效液相色谱法(HPLC)检测血药浓度。根据噻拉嗪在大鼠血药浓度检出值设立浓度梯度从而确定噻拉嗪在离体培养神经元的药物浓度。

1.6 样品的采集与酶活性的检测根据噻拉嗪在Wistar大鼠麻醉过程中的血药浓度检测值，确定其作用于神经细胞的浓度为15，25，35 μg/mL和45 μg/mL。培养神经元第8天时加入不同浓度噻拉嗪，每个浓度做3个平行试验。分别在加药后0、5、10、15、20、25、30、45、60、90 min和120 min进行细胞裂解，离心后分别取上清液40 μL置于EP管中，根据试剂盒的说明书进行后续的试验。

应用分光光度法测定Na+-K+-ATP酶和Ca2+-Mg2+-ATP酶活性，二者酶活性检测均使用超微量ATP酶测定试剂盒，具体试验步骤参照说明书。ATP可由ATP酶分解生成ADP及无机磷，因此，测定无机磷含量即可判断ATP酶活性的高低。组织或细胞中ATP酶活性可根据下面的公式进行计算：

细胞中ATPase活性(U/mgprot)=[(测定管OD值-对照管OD值)÷(标准管OD值-空白管OD值)]×标准管浓度(0.02 μmol/mL)×6*×7.8**÷匀浆蛋白浓度(mg/mL)

*：定义上为每小时，实际操作为10 min反应；**：反应体系中7.8倍稀释；蛋白浓度由考马斯亮兰法测定

1.7 数据分析与处理试验数据以“Mean ± SD”表示；两变量间的简单相关性采用直线相关回归分析，P<0.05为差异显著，P<0.01为差异极显著。

2 结果

2.1 神经元培养及鉴定

2.1.1 形态学观察细胞接种后连续8 d在显微镜下观察细胞形态。接种3 h后可见贴壁的神经元大小均一，胞体为圆形，分散均匀，包体周围有光晕包围(图1)；培养至第4天，从形态学上未见其他杂质细胞，神经元胞体变长，形态随突起的方向延伸，细胞间隐约出现突起交织状(图2)；培养至第8天，胞体成熟，突起充分延展且清晰，特征形态明显(图3)。

图2 大脑皮质神经元体外培养4 d (200×)

图3 大脑皮质神经元体外培养8 d (200×)

2.1.2 神经元的鉴定将培养第8天的神经元进行MAP-2免疫荧光鉴定。显微镜下观察可见神经元呈现荧光绿色，其中存在大量神经元，突起清晰且延展充分、形态良好、呈现典型的神经元形态(见封三彩版图4)。

2.2 不同浓度噻拉嗪对Na+-K+-ATP酶活性的影响如表1所示，4种不同浓度噻拉嗪(15 μg/mL、25 μg/mL、35 μg/mL和45 μg/mL)使Na+-K+-ATP酶活性均呈现先下降后上升趋势。25 min时，15 μg/mL，25 μg/mL和45 μg/mL 3组的Na+-K+-ATP酶活性为最低值，与0 min相比分别降低了63.72%，66.77%和64.63%(P<0.01)。随后这3组酶活性逐渐上升，其中15 μg/mL和45 μg/mL最高值均出现在60 min，与25 min时相比分别升高188.9%和181.8%(P<0.01)，25 μg/mL组在120 min时最高，与25 min相比上升208.4%(P<0.01)，与0 min相比差异不显著(P>0.05)。35 μg/mL组Na+-K+-ATP酶活性在15 min时降为最低值，下降了67.04%(P<0.01)，之后酶活性逐渐恢复，在120 min时最高，与15 min相比上升196.2%(P<0.01)，与0 min相比差异不显著(P>0.05)。

表1 不同浓度噻拉嗪对Na+-K+-ATP酶活性的影响

2.3 不同浓度噻拉嗪对Ca2+-Mg2+-ATP酶活性的影响如表2所示，15 μg/mL、25 μg/mL、35 μg/mL和45 μg/mL中Ca2+-Mg2+-ATP酶活性在不同的作用时间均受到抑制。15 μg/mL，25 μg/mL，35 μg/mL和45 μg/mL组Ca2+-Mg2+-ATP酶活性在25 min时降至最低值，较0 min降低了42.81%，68.91%，87.67%和80.14%(P<0.01)。随后Ca2+-Mg2+-ATP酶活性上升，15 μg/mL组在60 min时为最高值，与25 min相比上升46.95%(P<0.01)，与0 min比差异不显著(P>0.05)；25 μg/mL，35 μg/mL和45 μg/mL的Ca2+-Mg2+-ATP酶活性均呈现上升趋势，在120 min时，与最低值比分别上升了104.2%，420%和170.8%(P<0.01)。

表2 不同浓度噻拉嗪对Ca2+-Mg2+-ATP酶活性的影响

3 讨论

Na+-K+-ATP酶(又称Na+-K+泵)是一种普遍存在的P型ATP驱动阳离子转运蛋白，它可以将2个K+和3个Na+交换出细胞，从而建立穿过质膜的细胞工作电位。这种梯度对维持神经元信号传导、肌肉收缩具有至关的重要[3]。有学者研究认为，异氟醚、氯胺酮和氯丙嗪等麻醉药对中枢抑制作用可能与大脑皮质内Na+-K+-ATP酶活性下降有关[4-5]。此外，胡兴国等[6]研究异丙酚能使大脑皮层、脑干及海马突触体中的Na+-K+-ATP酶活性下降，从而发挥对中枢神经系统的抑制作用。同时研究表明，乌头碱能影响离体SD大鼠脑组织细胞中Na+、K+、Ca2+、Mg2+浓度而使细胞形态发生改变以及功能受损[7]。

本试验中，不同浓度的(15、25、35 μg/mL和45 μg/mL)噻拉嗪作用离体神经细胞后，各组Na+-K+-ATP酶活性都表现为先下降后上升的趋势，60 min到120 min酶活性逐渐恢复至0 min时水平。25 μg/mL、35 μg/mL和45 μg/mL这3组较15 μg/mL组出现显著下降趋势(P<0.05)。有研究表明，这主要是由于药物对Na+-K+-ATP酶的作用通过其不同亚基结构的变化来实现[8]，前期研究发现，噻拉嗪能有效抑制麻醉期鼠大脑皮质内Na+-K+-ATP酶活性，其活性变化可能与噻拉嗪麻醉效果的产生有一定关系[9]。噻拉嗪对Na+-K+-ATP酶活性的影响显著，可能是由于中枢抑制与神经元Na+-K+-ATP酶活性变化存在着关系。

Ca2+-Mg2+-ATP酶在维持细胞内Ca2+水平发挥重要作用，神经元的活动也依赖于细胞内Ca2+水平。诸多研究表明，不同类型的麻醉药均能使Ca2+-Mg2+-ATP酶活性降低从而实现麻醉作用[10-11]。当噻拉嗪作用浓度为15 μg/mL，作用时间10 min时，Ca2+-Mg2+-ATP酶活性显著降低(P<0.01)，随后逐步恢复到空白组水平，无显著差异。25 μg/mL、35 μg/mL、45 μg/mL组的Ca2+-Mg2+-ATP酶活性都表现为先下降后回升，25 min时噻拉嗪对酶活性的抑制作用最为明显，活性值最低，在120 min时，其仍对神经细胞Ca2+-Mg2+-ATP酶活性抑制作用显著(P<0.01)。主要是因为噻拉嗪作用于神经元后，抑制了Ca2+-Mg2+-ATP酶活性，胞内Ca2+大量蓄积，稳态失衡，使得神经细胞动作电位发生变化，从而发挥中枢抑制作用。然而随着麻醉时间延长，药物在神经细胞内发生代谢，药物的有效浓度下降，对中枢抑制作用减弱。韩光[12]通过研究山羊使用噻拉嗪麻醉的药物代谢动力学发现，在噻拉嗪麻醉90 min之后，山羊麻醉深度减弱，逐渐苏醒，此时血药浓度为56.6 ng/mL，对动物的麻醉效果较差，与本试验的结果一致。与此同时，研究证实异氟醚可以明显抑制丘脑皮质神经元细胞膜T-型钙通道的峰电流[13]，随后的生物物理学研究指出这种抑制在细胞膜去极化时更易发生。