非洲猪瘟后某猪场猪舍内的消毒程序及效果评价

杨瑞梅 ， 李桂梅 ， 秦志华 ， 单 虎

(青岛农业大学动物科技学院 ， 山东 青岛 266109)

非洲猪瘟(简称非瘟)是由非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)引起的一种急性、热性、高度接触性传染病，发病率高，死亡率可达100%[1]。自2018年我国报道首例非洲猪瘟病例以来，形成了较大污染面，疫情传入和传播渠道多，对我国养猪业产生了严重影响[2]。由于该病毒结构复杂，对机体免疫机制不完全清楚，该病目前没有有效疫苗，因此消灭非洲猪瘟病猪，杀灭环境中非瘟病毒，阻断传播，是目前防治该病的重要方法。可用消毒剂杀灭猪场中非瘟病毒，已报道有多种消毒剂可用来杀灭非瘟病毒[3-5]。但这些研究都是在实验室中模拟条件下进行的，猪场现场消毒及其效果目前报道很少。消毒剂的浓度、作用时间，消毒的程序都会影响到消毒效果。对非洲猪瘟后怎样消毒、消毒后效果检测，是每一个非瘟后准备恢复生产的猪场非常关心的问题，本试验参考文献[6-7]中非瘟后的消毒设计了中小规模猪场非瘟后消毒程序，应用于江苏某非瘟后猪场，并对每一消毒环节进行消毒效果检测，来了解中小规模猪场非瘟消毒程序及其效果，以期为指导养殖场科学规范开展消毒工作，切断动物疫病传播途径。

1 材料方法

1.1 材料 灭菌生理盐水、棉签、拉链式自封袋、防护服、鞋套、Eppendorf管、氢氧化钠、次氯酸钠、过硫酸氢钾、火焰喷灯、甲醛、高锰酸钾、营养琼脂、喷雾器等。

1.2 猪场概况 江苏苏北某猪场，自繁自养，母猪50头，2019年7月15日出现非洲猪瘟，确诊后7月20日做全场清群。

1.3 消毒方法

1.3.1 清扫前采样和检测 穿着防护服、鞋套等采样，人员进出时及时规范消毒。全面采样，包括死角、料槽底部等不宜采集到的位置。将5 cm×5 cm的灭菌规格板放在物体表面(包括地面、墙壁、围栏、漏缝地板、料槽、排污沟等)，用浸有无菌生理盐水的棉拭子(或含相应中和剂的棉拭子)1支，来回均匀涂满整个方格，并随之转动棉拭子，每个棉拭子采样1个方格，将棉拭子放入10 mL生理盐水采样管中。连续采样5个规格板。

将放有棉拭子的采样管充分震荡，用无菌吸管吸取1 mL待检样品接种于灭菌平皿中，每个样本接种2个平皿，如污染严重，可10倍递增稀释。将已融化的45 ℃左右的营养琼脂侵入平皿，每皿约15 mL，并立即旋摇平皿，冷凝后置(36±1) ℃培养箱中培养48 h，计数菌落数[8]。

细菌总数(CFU/cm2)=(平板上平均菌落数×稀释倍数)÷25

ASFV核酸检测：采用磁珠法提取样品DNA，用荧光定量PCR方法检测ASFV核酸，参照世界动物卫生组织(OIE)方法进行[9]。判定标准为阴性样品和空白对照的Ct值>40.0，阳性检测样品和阳性对照的Ct值<40.0。

1.3.2 猪舍内清洗消毒 遵循“清扫前消毒-清扫冲洗-再消毒”的原则。(1)清扫前消毒：先用消毒剂喷洒，以免病原随浮尘或附着物污染其他物品。用5%烧碱喷洒地面、围栏、墙壁、屋顶、通道及设施设备等，表面喷湿，有水流下为止。2 h后清扫。(2)清扫：彻底清除排泄物、垫料和剩余饲料，确保清扫干净。围栏、料槽、垫板、网架等设备尽可能的拆下到舍外进行消毒。(3)冲洗：先浸泡后冲洗。先用消毒药水对高床、垫板、栏杆、地面、墙壁和其他设备充分喷湿浸泡，1 h后高压热水冲洗干净，水温在70 ℃或以上(除去所有的油脂痕迹)。对拆下的各种设备，可在舍外用较大的池子，放5%的火碱进行浸泡3 h。不能拆卸的漏缝地板等，用刷子或钢丝球等将缝隙中的粪污等清理干净，高压水枪冲洗。

冲洗合格的标准为：地面、墙壁、缝隙、料槽、围栏无粪渣、剩料残渣和其他污物。粪沟内无可视粪便；料管表面及围栏和风机百叶无灰尘和污物。

检测细菌总数和ASFV核酸。

1.3.3 消毒 用消毒剂对舍内全面消毒。(1)3%NaOH：地面、墙壁、通道、排污沟、设备、用具，包括漏缝地板背面，喷洒至物体表面彻底湿润，2 h后再喷洒1次，作用4 h，然后用水冲洗。自然干燥2～3 d，检测消毒效果。(2)5%次氯酸钠溶液：同3%NaOH消毒步骤，检测消毒效果。(3)1∶100过硫酸氢钾溶液：同3%NaOH消毒步骤，检测消毒效果。(4)火焰喷枪灼烧：火焰灼烧的部位必须提前完全干燥。对可承受耐火焰的地面及墙壁等物体进行火焰消毒，表面光滑的物体烧3～5 s；粗糙的地面或区域15～30 s。检测消毒效果。(5)白化：用5%NaOH+20%石灰水，对墙壁、围栏、猪舍内过道、排污沟、地面高压水枪喷洒。检测消毒效果。(6)熏蒸消毒：按28 m3的空间用500 mL 40%福尔马林倒入200 g高锰酸钾中，随后封闭24 h，开门窗通气8 h。检测消毒效果。(7)空舍：打开门窗空舍10 d。检测消毒效果。

2 结果

2.1 消毒后猪舍内细菌总数检测 对该非瘟后猪场全场猪清群后，进行了清扫前的消毒-清扫冲洗-消毒等措施，细菌总数检测结果表明(见表1)，清扫冲洗后墙壁、地面等的细菌总数减少了70%～80%。3% NaOH喷洒消毒，冲洗后，细菌总数急剧减少，如墙壁减少了104倍，由1 009×104CFU/cm2到1 000 CFU /cm2。5%次氯酸钠溶液、1∶100过硫酸氢钾溶液作用后，细菌总数都明显减少。火焰灼烧后，墙壁、地面、漏缝地板、排污沟有少量细菌；食槽、围栏上无细菌。白化处理后，处理表面细菌数量极少，已完全达到猪舍内环境卫生标准。用甲醛熏蒸后，环境中细菌数量更少，仅在漏缝地板和排污沟中2 CFU /cm2，其余未检测到细菌。空舍10 d后细菌数量略有增加，但在环境合格范围内。

表1 猪舍内细菌总数检测结果

2.2 消毒后猪舍内ASFV荧光定量PCR检测 ASFV荧光定量PCR检测结果(见表2)：消毒前，环境中ASFV阳性，Ct值为23～26。清扫冲洗后ASFV数量减少，但仍能检出，经过3%NaOH、5%次氯酸钠溶液、1∶100过硫酸氢钾溶液作用后，除排污沟Ct值为36外，其余ASFV核酸检测均为阴性。火焰灼烧后，整个猪舍环境中ASFV核酸检测均为阴性。之后经过熏蒸消毒和空舍10 d，核酸检测仍为阴性。

表2 猪舍内ASFV荧光定量PCR检测结果

消毒检测结果表明，经过这个消毒程序，环境细菌总数降到了很低水平，环境中的非洲猪瘟病毒完全清除，取得了较好的消毒效果。

3 讨论

猪场发生非洲猪瘟后，为清除环境中非洲猪瘟病毒，进行全面彻底的消毒是必不可少的一个环节。消毒的程序和消毒剂的选用、作用时间等都与消毒效果有密切关系。本试验结合非瘟病毒和该病流行病学特点，设计了相应的消毒程序，并进行了消毒效果检测，以期为临床非瘟恢复生产提供借鉴。

本试验表明，用“清扫前消毒-清扫冲洗-再消毒”的方案是科学合理的方法。未进行任何处理时，地面大肠杆菌为5 100×104CFU /cm2，经过了清扫前消毒、清扫、热水冲洗后地面大肠杆菌降为1 300×104CFU /cm2，细菌数减少了近80%。表面机械性清扫、冲洗污物，有效降低环境中细菌含量，是使用消毒剂前的重要环节。因为它有效降低了有机物，便于消毒剂发挥作用。清扫冲洗后应用了多种消毒剂和消毒方法，以便彻底杀灭环境中的非洲猪瘟病毒。首先用了3% NaOH作用后，细菌总量急剧降低，如墙壁表面细菌数量降低了10 000倍，到了1 000 CFU/cm2，5%次氯酸钠溶液作用后降到300 CFU /cm2， 1∶100过硫酸氢钾溶液作用后降到50 CFU /cm2，此时已符合环境中细菌总数指标，而此时ASFV的荧光PCR检测，仅排污沟Ct值为36，其他均为阴性。之后再火焰彻底灼烧地面、墙壁、漏缝地板及背面等，再用白化即生石灰+火碱对墙面和过道高压喷洒，最后甲醛熏蒸，舍内非洲猪瘟病毒检测为阴性。

发生ASFV时常用消毒剂为过硫酸氢钾、戊二醛类、过氧乙酸等，因能高效杀菌，无毒无害，最终降解为水、氧气、CO2等，属环境友好型，并且过硫酸氢钾、过氧乙酸在低温下有效，因此防治非瘟可以选用。NaOH、生石灰等强碱类价格便宜，消毒高效，也被广泛使用。其他消毒剂包括：季铵盐类如新洁尔灭、含氯消毒剂如次氯酸钠、含碘类消毒剂均可使用。购买正品消毒剂，按照说明书比例正确配置浓度，保证作用时间，将会取得较好的消毒效果[10-11]。

因ASFV多用猪肺泡巨噬细胞培养，不易获得，并且在细胞培养时，易受环境中其他因素影响。检测环境中是否还有ASFV，目前主要采用猪场环境卫生指标结合ASFV荧光定量PCR检测，2个指标合格的方法进行。猪场环境卫生指标在达到细菌总数<200 CFU /cm2为合格[12]。当环境中细菌总数指标达标时，因为经过多次冲洗，ASFV荧光定量PCR检测也为阴性。两者有较好的一致性，但是能否以细菌总是代替ASFV核酸检测还需后期大量试验验证。