益气养阴方含药血清联合化疗药对KG1α细胞活性的影响*

周琦浩 宁方颖 李双双

1 浙江省人民医院望江山院区 浙江 杭州 310024

2 浙江省人民医院 浙江 杭州 310014

3 浙江省肿瘤分子诊断与个体化治疗重点实验室 浙江 杭州 310014

本研究选取单纯的益气养阴中药（黄芪、太子参、女贞子、旱莲草、麦冬），制备大鼠含药血清，联合化疗药（阿糖胞苷、喜树碱、紫杉醇），共同作用于人白血病细胞系KG1α细胞，观察细胞的增殖抑制率、凋亡、细胞周期等。探讨益气养阴方联合化疗药对KG1α细胞活性的影响和机制。

1 实验材料

1.1 动物和细胞株：采用8周龄、清洁级雄性Wistar大鼠36只，体重200g±20g，由上海斯莱克实验动物有限公司提供。KG1α细胞株购于BNCC细胞库。

1.2 药物及试剂：中药材由杭州华东医药有限公司提供。喜树碱、阿糖胞苷、紫杉醇：Aladdin公司。GAPDH抗体：CST公司；CD44、P21、survivin、SDF-1：abcam公司。

2 实验方法

2.1 药物制备及剂量：益气养阴方：黄芪、太子参各30g，女贞子21g，旱莲草18g，麦冬15g。药液煎煮按照常规水提法进行：即煎煮前先用凉水浸泡30min，煎煮2次。浓缩至1.14g/ml，冷却分装，4℃备用。根据“动物与人体的每公斤体重剂量折算系数表”来计算大鼠灌胃中药的剂量。对照组给予等量生理盐水。

2.2 含药血清的制备：将大鼠随机分为空白对照组和含药血清组，分2次给灌胃（9∶00am、3∶00pm），灌胃7天。末次给药2h后，大鼠称重，按3.8ml/kg的量用10%水合氯醛腹腔注射麻醉，取血前应探明心脏搏动最强部位，通常在胸骨左缘正中，选心跳最明显的部位作穿刺。灭活。-20℃冷冻保存备用，2个月内用完。若是4℃保存，1周内用完。

2.3 细胞培养：KG1α细胞的培养条件：含10%FBS的IMDM培养基，37℃、5%CO2、饱和湿度培养箱中培养。

2.4 CCK8检测细胞活力：取正常培养的处于对数期的细胞铺96孔板。含药血清分为：5%、10%、15%、20%4个浓度血清，化疗药物作用浓度：阿糖胞苷 160μg/ml，喜树碱0.1μg/ml，紫杉醇 50μg/ml。设置组别为：空白对照组，空白血清对照组，单独含药血清组，单独化疗药组，含药血清联合化疗药组。药物作用细胞0h、12h、24h、48h、72h。每孔加入10μl CCK8检测液的工作液，37℃避光反应2h，450nm处读取各孔OD值。实验结果按下式计算：细胞存活率（%）=实验组OD值/空白对照组OD值×100%。

2.5 流式检测凋亡：细胞铺6孔板，加入药物处理后分别于12h、24h、48h后收集细胞样本进行凋亡检测。收集细胞重悬，加入5μl的Annexin V-FITC混匀后室温避光孵育15min，加5μl的PI混匀后，室温避光孵育5min；加200μl的1×Binding Buffer流式上机检测。

2.6 流式检测细胞周期：细胞铺板，换成无血清的培养基同步化24h；加入药物处理后分别于12h、24h、48h后收集细胞样本进行周期检测。收集细胞，无水乙醇固定好的细胞，水化，离心收集，PBS清洗，加入1ml的 Reagent A溶液，轻柔涡旋混匀后，室温避光孵育30min。流式上机检测。

2.7 WB检测蛋白：细胞铺板，加入不同药物和含药血清处理，药物作用48h。制备蛋白样品，进行蛋白浓度测定，聚丙烯酰胺凝胶电泳、转膜、封闭、孵育一抗、洗膜、孵育二抗、洗膜、ECL化学发光显影。导出照片后在Image J软件下分析各条带光密度。

3 实验结果

3.1 细胞活力结果：①含药血清对KG1α细胞有一定的增殖抑制作用，12h最为明显，抑制作用随着时间推移而减弱，这可能与血清衰老相关；以15%抑制作用最为明显（图1）。②阿糖胞苷对于KG1α细胞的抑制效果不明显，直到在72h才开始出现轻度抑制细胞增殖（增殖率86.6%±1.1%），无统计学意义（P＞0.05）；但在含药血清的作用下，阿糖胞苷对细胞的抑制明显增加，从作用12h-5%的含药血清开始抑制明显（72.4%±8.3%），48h-15%含药血清最为明显（65.3%±4.1%），相比于对照组以及同时间点同浓度的阿糖胞苷有统计学意义。③喜树碱在与细胞作用12h出现抑制效果(15%空白血清77.9%±2.6%)，并随着时间增加而增加；在含药血清的作用下，抑制更明显（48h15%空白血清58.1±2.9%VS含药血清27.1%±3.8%），对于空白组和同时间同浓度的单用喜树碱组有显著统计学意义。④紫杉醇对于细胞的抑制率不明显，在72h出现一部分的抑制率（72h15%空白血清68.1%±0.2%）；但在含药血清作用下，12h即出现明显抑制（12h15%空白血清85.9%±6.4%VS含药血清53.6%±1.8%），相比于空白组和同浓度血清组有统计学意义。因15%含药血清效果较为明显，后面的实验浓度采用血清浓度为15%，因72h细胞老化比较明显，故后续实验不再加入。

图1 不同浓度时间的含药血清的KG1α细胞增殖抑制率

3.2 凋亡结果：在15%浓度血清下，12h、24h细胞凋亡并不明显，48h各组细胞出现凋亡（图2）。空白血清+化疗药组，各组凋亡情况差异不大；但化疗药联合含药血清48h后，阿糖胞苷、紫杉醇比空白血清化疗药组的细胞凋亡更加明显，有统计学意义（P＜0.005）。

图2 不同时间点各组细胞的凋亡情况

3.3 细胞周期结果：阿糖胞苷阻滞细胞在G1期，与对照组相比，3个时间点对照组+阿糖胞苷组G1期都延长；紫杉醇能够明显阻滞细胞的G2/M期，与对照组相比，3个时间点单用紫杉醇组G2/M期都延长；喜树碱阻滞细胞在S期和G2/M期，与对照组相比，3个时间点单用喜树碱组S期和G2/M期都延长。且各给药组48h均出现了不同程度的凋亡峰和碎片区。但含药血清联合化疗药组与对照组对细胞周期的影响差异不大。

3.4 WB结果：由WB显示的蛋白变化（图3）可以看出：阿糖胞苷能使细胞的CD44蛋白明显下降，联合含药血清后使下调稍增加；喜树碱能轻度增加CD44的表达，联合含药血清后表达更强；紫杉醇能使细胞的CD44表达稍下降，含药血清组下降更为明显。阿糖胞苷、喜树碱使细胞的P21稍下调，联合含药血清组，下调进一步增加；紫杉醇使细胞的P21下降明显，含药血清进一步加强下调。阿糖胞苷能下调survivin表达，含药血清稍加强此作用；喜树碱、紫杉醇对survivin作用不明显，紫杉醇联合含药血清能下调survivin表达。阿糖胞苷能明显下调细胞SDF-1蛋白；喜树碱对SDF-1变化不是很明显；紫杉醇能下调SDF-1，含药血清组加强此作用。

图3 细胞的CD44、P21、suvivin、SDF-1蛋白表达情况

4 讨论

目前，治疗白血病的方式主要是采用联合化疗或骨髓移植。骨髓移植存在着配型难、移植物抗宿主病、复发等诸多问题，而化疗药对机体免疫系统和造血系统的损伤也十分严重，并且许多患者易出现耐受。因此能找到增敏减毒有效的方法，抑制白细胞细胞增生诱导其凋亡、增加化疗药敏感性，将会开启治疗血液肿瘤的新篇章。随着现代技术的发展，中药的抗肿瘤作用得到了更好研究和运用。根据其临床表现及发展特点，本病可归为中医学“虚劳”“癥瘕”等范畴。根据《黄帝内经》“邪之所凑，其气必虚”的理论，白血病的发生与体内正气不足、易感邪气有关。但毒邪入侵一般不是马上发病，有一个潜伏期，毒邪久恋，暗耗气血，耗竭阴津，阴津亏虚，则气无所依附，从而气更虚。故益气养阴法是中医药治疗白血病的方法之一。在本研究中，用来制备含药血清的益气养阴方主要由益气的黄芪、太子参，和养阴的女贞子、旱莲草、麦冬组成，未加入清热解毒等祛邪之类的攻药，探讨补法治疗白血病的机制。

在本研究中，人白血病细胞系KG1α对160μg/ml浓度的阿糖胞苷、50μg/ml的紫杉醇并不是很敏感，在与细胞作用48h之前，对细胞的增殖抑制、凋亡都不明显，但联合了含有益气养阴方的大鼠血清后，白血病细胞的增殖抑制、凋亡都明显增加。0.1μg/ml的喜树碱对KG1α的抑制效果较明显，含药血清能进一步增强抑制作用。但含药血清的加入并未改变化疗药对细胞周期的影响。

CD44是细胞膜上广泛分布的一种跨膜糖蛋白，属于黏附分子。能与胶原、透明质酸等细胞外基质相互作用而参与血管的新生及肿瘤细胞的黏附、增殖、分化、迁移及浸润等过程。研究表明CD44高表达与造血系统恶性肿瘤病情进展及预后不良密切相关[1]。本研究中阿糖胞苷能大幅度降低白血病细胞KG1α的CD44表达，联合益气养阴中药血清后，表达进一步下降。紫杉醇能轻度降低CD44的表达，联合含药血清后，下降更明显。喜树碱对其变化不明显。SDF-1又称前B细胞刺激因子，属于趋化因子CXC亚家族成员，主要由骨髓基质细胞和不成熟的成骨细胞分泌，是包括造血干细胞和淋巴细胞在内的多种细胞的高效趋化因子。其配体有CXCR4和CXCR7等，SDF-1/CXCR4在Aml形成中发挥着重要作用，化疗后CXCR4高表达提示预后不良[2]，CXCR7在正常人的骨髓、外周血、脐带血中表达较低，但在白血病细胞高表达[3]。本研究中阿糖胞苷能大幅度降低白血病细胞KG1α的SDF-1蛋白表达，因降低作用明显，联合益气养阴中药血清后蛋白并未进一步下降。紫杉醇能轻度降低SDF-1的表达，联合含药血清后，下降更明显。喜树碱对其变化不明显。P21是细胞周期蛋白，可以抑制周期蛋白依赖性激酶的活性，对细胞周期发挥调控作用。本研究中阿糖胞苷、喜树碱能轻度下降P21蛋白表达，紫杉醇能较明显地降低其表达，联合含药血清后下降更明显。但是流式细胞检测，联合含药细胞周期变化不明显。Survivin是凋亡抑制蛋白家族的成员，参与细胞凋亡。

在本研究中可以观察到益气养阴含药血清对白血病细胞KG1α体外的抑制作用，使对阿糖胞苷、紫杉醇不敏感的KG1α细胞在12h即出现增殖被抑制的效果，并且细胞凋亡进一步增加。本实验的含药血清中虽无“祛邪”的成分，但其“益气养阴”的作用使KG1α细胞发生了改变，对化疗药更为敏感，细胞增殖抑制、凋亡都进一步加强，这可能与CD44、SDF-1等蛋白表达改变相关。血液肿瘤的发生发展是由多种蛋白和细胞因子参与其调控的，其具体机制有待更深入的研究。