基于蒙脱石负载的阿糖胞苷复合物的制备

谢华松,刘泽朗,刘嘉姚,胡燕芸,王传岭

(嘉应学院,广东 梅州 514031)

阿糖胞苷(Cytosine arabinoside,Ara-c),为白色或类白色细小针状结晶或结晶性粉末,在水中极易溶解,它属于嘧啶核苷类抗肿瘤药物,用于治疗以急性淋巴细胞白血病和非霍奇金淋巴瘤为主的各种类型的白血病[1]。目前阿糖胞苷在治疗过程中存在严重缺陷:1)在体内容易在脱氨酶的作用下发生脱氨基反应,转变为无活性的阿糖尿苷;2)分子水溶性大,膜透过性差;3)半衰期短,只有10～20 min;4)用于实体瘤的治疗效果差;5)常出现手足综合征(HFS)和口腔炎等副作用[2-3]。阿糖胞苷由于以上缺点导致其在临床上应用受到限制,因此,探索开发载药量高、安全有效的 Ara-C药物递送系统成为当前急需解决的问题。

天然蒙脱石(MMT)是由两层硅氧四面体夹一层铝(镁)氧八面体构成的2∶1型层状硅酸盐黏土矿物,是组成膨润土的主要矿物,其晶体结构中的两个结构单元层以分子间力结合,结构比较松散,四面体中的Si4+可以被Al3+置换,八面体中的Si4+、Al3+易被Mg2+、Fe2+、Fe3+、Zn2+、Mn2+等置换,形成一系列复杂化学成分和层间负电荷,这些特征赋予它遇水膨胀、吸附、带电和离子交换特性具有非常高的比表面积、较大的阳离子交换容量和可膨胀性[4]。在生物医药领域,蒙脱石可作为生物分子层间吸附剂[5]、药物载体[6]和电化学生物传感器[7]等。

近几年来国内外大量学者研究发现蒙脱石是一种性能优良的缓控释制剂载体,并已有多种药物以蒙脱石作为新型缓控释载体的研究报道,如:蒙脱石负载5 -氟尿嘧啶[8]、盐酸异丙嗪[9]、紫杉醇[10]、布洛芬[11]等。由于蒙脱石具有良好的生物惰性、吸附性和离子交换容量,作为载体它还具备吸附量大、稳定性好、将药物分子吸附交换至层间,延长药物的半衰期,减少用药剂量,起到“缓释、控释”的作用。本文拟设计制备阿糖胞苷-蒙脱石复合物,并测定蒙脱石对阿糖胞苷的载药量,为后期开发具有缓释作用的新型阿糖胞苷-蒙脱石复合物提供理论基础。

1 实验材料

仪器:电热恒温鼓风干燥箱(101-3型),上海锦屏仪器仪表有限公司;超声波清洗机(JP-100S型),深圳市洁盟清洗设备有限公司;集热式恒温磁力搅拌器(DF-101S型),常州越新仪器制造有限公司;电子分析天平(AL204型),梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司;X-射线衍射仪(X’Pert PRO MPD型),荷兰Panalytical公司;热重分析仪(Q500型),美国TA公司;傅里叶红外光谱仪(IS5/IS10型),美国Thermo Nicolet公司;高效液相色谱仪(LC-2030 plus型),岛津马来西亚工厂;离心机(GL-25M型),上海赵迪生物科技有限公司;超纯水机(MING-CHE 24UV型),法国Merck Millipore公司;酸度计(PHSJ-4A型),上海精密科学仪器有限公司。

试剂:钠基蒙脱石(上海源叶生物科技有限公司);阿糖胞苷(C9H13N3O5)(上海源叶生物科技有限公司);聚乙二醇(PEG1000)(上海源叶生物科技有限公司);高效色谱纯甲醇(西陇科学股份有限公司);磷酸二氢钠,二水(NaH2PO4·2H2O)(阿拉丁);氢氧化钠(NaOH)(天津市福晨化学试剂厂);磷酸氢二钠,十二水(Na2HPO4·12H2O)(阿拉丁);磷酸二氢钾(KH2PO4)(天津市大茂化学试剂厂)。

2 实验方法

2.1 钠基蒙脱石有机化改性处理[12]

取市售钠基蒙脱石(MMT) 5.0 g于40 mL蒸馏水中,在60 ℃恒温超声分散15 min,在恒温磁力搅拌器中60 ℃分散2.0 h,随后加入0.20 g PEG1000,继续搅拌1.5 h,反应完成后加入乙醇沉淀并离心,烘干研磨即得改性蒙脱石,以下蒙脱石均采用已改性蒙脱石进行实验。

2.2 阿糖胞苷-蒙脱石复合物的制备[13]

取阿糖胞苷0.200 0 g,加入pH值=7.6的PBS溶液50 mL,超声分散15 min,加入0.500 0 g改性蒙脱石,于45 ℃恒温反应3.0 h,取出,以10 000 r/min离心15 min,倒去上清液,将剩余下层沉淀烘干,待水分完全烘干后研磨成粉末状,即得。

2.3 阿糖胞苷-蒙脱石复合物的结构表征

2.3.1 X射线衍射(XRD)表征

采用X射线粉末衍射分别对空白改性蒙脱石和阿糖胞苷-蒙脱石复合物测定,以8 °/min的速度在3°～70°范围内进行扫描。

2.3.2 傅里叶红外光谱(FT-IR)表征

采用傅里叶红外光谱检测,分别对空白改性蒙脱石和阿糖胞苷-蒙脱石复合物测定,用粉体常规压片,波长范围400～4 000 cm-1。

2.3.3 热重分析(TG-DTG)表征

采用热重分析分别对空白改性蒙脱石和阿糖胞苷-蒙脱石复合物测定,测试温度范围为25～799 ℃,测试气体氛围为氮气,升温速率10 ℃/min。

2.4 蒙脱石对阿糖胞苷的吸附实验

2.4.1 供试品溶液的制备

取0.200 0 g阿糖胞苷,加入pH值=7.6的PBS溶液50 mL,超声分散15 min,加入0.500 0 g 改性蒙脱石,于45 ℃恒温反应3.0 h,取出,以10 000 r/min离心15 min,吸取上清液,0.22 μm微孔滤膜过滤,取续滤液稀释至适合浓度,即得。

2.4.2 对照品溶液的制备

取阿糖胞苷对照品适量,精密称定,加超纯水溶解并定量稀释制成每l mL中含40 μg阿糖胞苷的溶液,作为对照品溶液。

2.4.3 色谱条件[1,14]

色谱柱:用十八烷基硅烷键合硅胶(4.6 mm×250 mm,4 μm)为填充剂;流动相:以磷酸盐缓冲液[V(取0.010 6 mol/L磷酸二氢钠溶液与0.010 4 mol/L磷酸氢二钠溶液等体积混合)∶V(甲醇)=95∶5];柱温:30 ℃;取适量阿糖胞苷标准品进行全波长扫描,确定检测波长为271 nm;设置流速:0.8 mL/min;进样量:10 μL,洗脱时间:8 min。

2.4.4 阿糖胞苷标准曲线[1,14]

精密称取阿糖胞苷约10 mg置于10 mL容量瓶中,分别用pH值7.6 PBS溶液溶解并定容,配成质量浓度为1 mg/mL的储备液。精密量取储备液50,100,200,400,600 μL置于10 mL容量瓶中,用PBS溶液稀释并定容得质量浓度为5,10,20,40,60 μg/mL的标准溶液,各进样10 μL,按照2.4.3项测定其峰面积,以峰面积(A)对浓度(C)作线性回归,得阿糖胞苷标准曲线。

2.4.5 蒙脱石的载药量[1,2]

按照2.4.1项平行制备三份供试品溶液,精密量取供试品溶液各10 μL ,注入HPLC中,记录色谱图,按标准曲线法计算阿糖胞苷游离量,然后以公式(1)计算蒙脱石对阿糖胞苷的载药量。

载药量(%)=载药蒙脱石中阿糖胞苷含量/载药蒙脱石的总质量×100%

(1)

3 结果与讨论

3.1 阿糖胞苷-蒙脱石复合物的结构表征

3.1.1 X射线衍射(XRD)表征分析

按照2.4.1项对空白改性蒙脱石和阿糖胞苷-蒙脱石复合物进行XRD表征,见图1,根据布拉格方程2dsinθ=nλ(n=1),可以计算出,其001晶面的层间距分别是1.560和1.718 nm,可见复合物中d001值比空白改性蒙脱石的大,说明可能由于阿糖胞苷的插入会占据原来空白改性蒙脱石晶体结构的一部分空间,使得材料的层间距(d值)增加,所以初步确定阿糖胞苷插入在蒙脱石层间;另一方面,插层后复合物的衍射峰角度比空白改性蒙脱石的要小,分析其原因可能是阿糖胞苷插入后占据了原来材料基本晶格结构中的空隙,引起晶格收缩,从而导致衍射峰角度出现左移变化。由以上两方面综合分析可判断阿糖胞苷成功插入蒙脱石层间,这与郭文姬等人的文献[15]描述相一致。

图1 阿糖胞苷-蒙脱石和空白改性蒙脱石的XRD谱

3.1.2 傅里叶红外光谱(FT-IR)表征分析

按照2.4.1项对空白改性蒙脱石和阿糖胞苷-蒙脱石复合物进行FT-IR表征,结果见图2。由图2可知,空白改性蒙脱石和阿糖胞苷-蒙脱石复合物的FT-IR表征,发现空白改性蒙脱石在3 629和3 468,1 639 cm-1处的波峰分别是由Al-OH和吸附水中的羟基振动引起的。1 096和1 036 cm-1处的波带是由Si-O平面振动引起的,大约在915 cm-1处的波数与Al-Al-OH有关,792 cm-1和大概630 cm-1处的波数是由Si-O-Si所引起的,而大约520和470 cm-1处的波数则是由Al-O-Si的振动引起。而在3 600 cm-1处的波峰变弱,分析其变弱的原因是阿糖胞苷和蒙脱石在反应过程中,蒙脱石中的游离型-OH基团大部分转变成了缔合型-OH基团,游离型-OH基团在红外光谱中常表现为强的吸收峰,而缔合型-OH基团在红外光谱中表现为弱的吸收峰,导致缔合型的吸收峰弱于游离型,所以-OH振动峰变弱,综合以上结果表明蒙脱石与阿糖胞苷应该形成了复合物。

图2 阿糖胞苷-蒙脱石和空白改性蒙脱石的FT-IR谱

3.1.3 热重分析(TG-DTG)表征分析

按照2.4.1项对空白改性蒙脱石和阿糖胞苷-蒙脱石复合物进行TG-DTG表征,见图3、图4。由图3中可知,空白改性蒙脱石从室温到200 ℃范围内,存在较大的失重损失,有4%左右,表明吸附水逸出;随着温度上升,在300～500 ℃处出现明显失重,大约4%左右,可能是由于蒙脱石晶格内羟基破坏开始释放水;在700 ℃之后出现第三个明显失重,可能是蒙脱石结构已造成破坏。由图4中可知,阿糖胞苷-蒙脱石复合物有两个比较明显的失重台阶。从室温到200 ℃的范围内存在6%左右的失重,对比空白改性蒙脱石,多出了2%左右的失重,表明是部分吸附水挥发和阿糖胞苷热分解引起的;随着温度的继续升高,在300～650 ℃的范围内,失重损失为2%左右,对比改性蒙脱石,要比蒙脱石少2%左右,说明阿糖胞苷与蒙脱石进行插层时失去了蒙脱石层间部分水,导致其失重偏小;当温度达到700 ℃后,失重曲线回升,可能是阿糖胞苷的分解产物与蒙脱石反应引起的,表明阿糖胞苷与蒙脱石形成了复合物。

图3 空白改性蒙脱石的TG-DTG谱

图4 阿糖胞苷-蒙脱石的TG-DTG谱

3.2 蒙脱石对阿糖胞苷的吸附实验

3.2.1 阿糖胞苷的最大吸收波长测定

按照2.4.2项制备对照品溶液,然后取适量阿糖胞苷对照品进行全波长扫描,结果见图5。由图5可知,在271 nm处有最大吸收,由此确定检测波长为 271 nm。

图5 阿糖胞苷全波长扫描图

3.2.2 阿糖胞苷在3种溶液下的标准曲线

按照2.4.4项建立阿糖胞苷在pH值7.6 PBS溶液的标准曲线,结果见表1;以峰面积(A)对浓度(C)作线性回归方程,得阿糖胞苷在相应释放介质下的标准曲线,据标准曲线计算出线性拟合方程(y= 29 292x+ 4 870.9),相关系数为0.999 9,结果显示标准曲线线性关系良好。

表1 阿糖胞苷在pH值7.6 PBS溶液的标准曲线测定结果

3.2.3 蒙脱石的载药量

蒙脱石对阿糖胞苷的吸附实验结果见表2,由表2可知,蒙脱石载药量约为1.42%,结果表明,蒙脱石对阿糖胞苷的载药量不是很高,后续可深入探究优化阿糖胞苷-蒙脱石复合物的制备工艺条件。

表2 蒙脱石对阿糖胞苷的吸附实验结果

4 结论

本文设计制备阿糖胞苷-蒙脱石复合物,通过结构表征分析确定制备得到阿糖胞苷-蒙脱石复合物,其载药量约为1.42%,研究结果为制备新型阿糖胞苷-蒙脱石缓释制剂提供参考依据,也为其在药理学的研究提供理论支撑。