芍药甘草汤含药血清对哮喘大鼠T淋巴细胞凋亡及p-Akt磷酸化表达水平的影响*

何 飞 汝触会 郑 琦 季也民 徐俭朴 蔡宛如

1 浙江省中西医结合医院 浙江 杭州 310003

2 天台县人民医院 浙江 天台 317200

3 浙江中医药大学附属第二医院 浙江 杭州 310005

支气管哮喘是一种具有异质性慢性气道炎症性疾病，发病人数众多，传统中医药在支气管哮喘防治方面具有较好效果[1]，芍药甘草汤作为著名经方之一，目前已广泛应用于临床，我们前期研究发现其能调节哮喘大鼠Treg/Th17细胞失衡的作用[2]。本项目运用血清药理学方法，利用体外实验观察芍药甘草汤含药血清对哮喘大鼠T淋巴细胞凋亡及淋巴细胞p-Akt水平的干预作用，以研究该经方防治支气管哮喘的作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物：SPF级雄性SD大鼠，体质量250±20g。由上海西普尔-必凯实验动物有限公司提供［动物生产许可证号SCXK（沪）2013-0016］。饲养条件：恒温，温度22±2℃，湿度50%～60%，光照每12小时明暗交替，换风次数15～20次/小时。由浙江中医药大学动物实验研究中心饲养［实验饲养室许可证号SYXK（浙）2013-0184］。实验动物的处置严格按照浙江中医药大学动物实验中心的伦理相关规定进行。

1.2 试剂及仪器：芍药甘草汤由浙江省中西医结合医院制剂室制成流浸膏（芍药和甘草的比例1∶1）,生药含量1g/ml；卵白蛋白（Sigma公司，货号：SLBB5992V）；氢氧化铝（Thermo公司，货号：77161）；P-AKT抗体（Affinity公司，货号：AF0908）；PI3K抑制剂 LY294002（sigma公司，货号：19-142）；CO2培养箱（SANYO公司，XD-101）；流式细胞仪（Becton-Dickinson公司，FACS Calibur）；酶标仪（BioTek公司，ELx800）；核酸电泳仪（北京六一公司，DYY-6B）。

1.3 实验方法：分述如下。

1.3.1 哮喘大鼠模型建立：SD大鼠（雄性）20只，使用腹腔注射卵白蛋白（OVA）致敏并雾化诱发建立大鼠哮喘模型，在第1天、第8天分别腹腔注射造模液1ml（含氢氧化铝100mg、卵白蛋白100mg）致敏。从第15天开始，大鼠装入雾化容器（30L）内，使用1%卵白蛋白激发液超声雾化激发，时间为30分钟/天，连续4周。于末次激发后处死大鼠，取脾脏以备T细胞培养所用。

1.3.2 芍药甘草汤含药血清制备：取雄性SD大鼠20只，平均分为芍药甘草汤组与空白组，每日固定时间灌胃，灌胃前禁水禁食6小时。芍药甘草汤组予芍药甘草流浸膏5g/kg灌胃给药，空白组给予等剂量生理盐水灌胃给药；釆用每天1次，连续灌胃7天。于第7天腹主动脉取血，收集大鼠血液，自然凝固，300rpm离心，收集上层血清，56℃灭活30分钟，取出后进行无菌过滤，后放入-20℃箱保存，为含药血清。

1.3.3 哮喘大鼠脾脏原代T细胞分离和培养：将脾脏剪成10mm3碎块，置于200目尼龙网上，用一次性注射器内芯轻轻碾磨，淋巴细胞分离缓冲液冲洗；通过密度梯度离心收集淋巴细胞；将淋巴细胞分离缓冲液2ml与脾脏细胞悬液2ml，1：1稀释后混匀，缓慢加入至含有Ficoll-Paque液试管的液面上，注意保持分层；用吸液管小心将白色的单核淋巴细胞层吸出重悬浮于RPMI1640培养基重悬培养，并进行细胞计数；然后加入尼龙毛柱中孵育60min，除去与尼龙毛结合的B淋巴细胞，收集T淋巴细胞，接种培养瓶，加入适量RPMI1640培养基，置于培养箱中培养24h，换液。

1.3.4 分组：哮喘大鼠脾脏原代T细胞分离和培养后分为6个组：空白对照组（10%胎牛血清），阴性对照组（10%不含药大鼠血清），芍药甘草含药血清分为5%、10%、20%3个浓度组及 PI3K抑制剂LY294002作为工具药物的阳性对照组。各组T细胞使用10%胎牛血清的MEM静止同步培养24h后，分别加入空白对照血清、阴性对照血清、5%、10%、20%芍药甘草药物血清和PI3K抑制剂LY294002的RPMI-1640培养基。

1.3.5 MTT比色试验法检测各组细胞生长抑制情况：取对数生长期细胞，按不同组设定6个复孔，每孔8000个细胞接种于96孔板，并分别加入含有对应浓度的血清RPMI-1640培养基，在5%CO2、37℃培养24h。细胞处理24h后，在每孔中加入10μl的MTT，再置于37℃，5%CO2培养箱内避光孵育3～4h。孵育完成后，吸净孔内液体，再加入200μl的DMSO溶解贴壁细胞，置于摇床室温震荡10min。在λ=490nm采用酶标仪测定各组同一时间点的OD值，最后进行细胞增殖影响的分析。

1.3.6 流式细胞仪检测各组细胞凋亡率：将对数生长期的细胞消化接种到6孔板中，次日待细胞贴壁后，根据组别，设置加入相应的含药培养基，药物作用后，用0.25%胰酶（不含EDTA）消化收集细胞；用PBS重悬细胞2次，2000rpm离心5min，收集5×105细胞；加入500µl的Binding Buffer悬浮细胞，接着加入5µl的Annexin V-FITC混匀后，避光，室温孵育15min；再加入5µl的PI染色，轻轻混匀细胞，于避光条件下室温孵育10min，用流式细胞仪检测细胞凋亡的情况。

1.3.7 流式细胞仪测定各组细胞周期：取细胞浓度为1×105cells/ml的细胞悬液，按上述实验分组处理细胞后，接种于6孔细胞培养板中，每孔加入3ml细胞悬液，置于37℃，5%CO2细胞培养箱中培养24h；将孔板中的细胞经胰酶消化后，收集至离心管中，2000rpm离心5min，弃去上清；用2mlPBS液洗涤细胞沉淀2次；离心去上清，再加入预冷的70%甲醇1ml，4℃固定4h以上；固定好后，1000rpm离心3min，弃去上清液，再用PBS洗细胞沉淀 1次，1000rpm离心 3min；加 100μl RNase A 37℃水浴30min；再加入400μl PI染色混匀，4℃避光30min；上机检测，记录激发波长488nm处红色荧光。

1.3.8 Western Blot检测各组细胞p-Akt磷酸化水平：取细胞浓度为1×105cells/ml的细胞悬液接种于96孔板中，根据组别加入相应药物，共孵育48小时，提取蛋白后通过Western Blot方法检测各组细胞p-Akt磷酸化水平。使用Gel-Pro32软件对结果进行灰度分析。

1.4 统计学方法：采用SPSS 22.0统计软件进行数据分析，所有数据以均值±标准差（±s）表示，不同组间两两比较采用单因素方差分析（One-way ANOVA）中的LSD法（最小显著性法），P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 MTT比色试验法检测各组细胞生长抑制情况：从表1可知，空白对照组与阴性对照组比较，两组对大鼠T淋巴细胞生长基本无差别，排除血清这一干扰因素。与空白对照组比较，5%、10%和20%含药血清显著抑制大鼠T淋巴细胞生长（P＜0.01），且呈现剂量依赖性。同时PI3K抑制剂LY294002阳性对照组与空白对照组存在显著差异（P＜0.01）。

表1 芍药甘草含药血清对大鼠T淋巴细胞生长抑制情况（±s，n=8）

表1 芍药甘草含药血清对大鼠T淋巴细胞生长抑制情况（±s，n=8）

注：与空白对照组比较，**P＜0.01。

组别空白对照组阴性对照组5%含药血清组10%含药血清组20%含药血清组LY294002组抑制率（%）-1.08±1.30 6.54±2.31**11.49±4.70**23.77±0.83**42.39±0.87**OD值1.15±0.04 1.13±0.01 1.08±0.03 1.02±0.05 0.88±0.01 0.66±0.01

图1 芍药甘草含药血清对哮喘大鼠T淋巴细胞凋亡的影响（n=8）

2.2 流式细胞仪检测各组细胞凋亡率：空白对照组与阴性对照组比较，两组血清对细胞凋亡基本无差别（P＞0.05），排除血清这一干扰因素。与空白对照组比较，5%、10%和20%的芍药甘草含药血清对促进大鼠T淋巴细胞凋亡，且呈现剂量依赖性（P＜0.01）。见图1。

2.3 芍药甘草含药血清对哮喘大鼠T淋巴细胞周期的影响：空白对照组与阴性对照组比较，两组血清对大鼠T淋巴细胞周期影响基本无差别，排除血清这一干扰因素。与空白对照组比较，5%、10%和20%的芍药甘草含药血清组G0/G1期细胞比例显著增加（P＜0.01），10%和20%的芍药甘草含药血清组的S期细胞比例显著增加（P＜0.01），G2/M细胞比例显著减少（P＜0.01）。见表2。

表2 芍药甘草含药血清对哮喘大鼠T淋巴细胞周期的影响（±s，n=8）

表2 芍药甘草含药血清对哮喘大鼠T淋巴细胞周期的影响（±s，n=8）

注：与空白对照组比较，**P＜0.01。

组别空白对照组阴性对照组5%含药血清组10%含药血清组20%含药血清组LY294002组G2/M（%）24.28±0.53 23.78±0.30 20.44±0.15**16.49±0.08**13.49±0.42**9.38±0.32**G0/G1（%）40.71±0.38 41.34±1.17 43.80±0.82**45.47±0.40**46.38±0.31**53.15±0.38**S（%）35.19±0.90 34.89±1.03 35.10±0.69 37.70±0.49**40.13±0.57**37.46±0.52*

2.4 各组大鼠T淋巴细胞中p-Akt磷酸化表达水平：空白对照组与阴性对照组比较，两组的p-Akt磷酸化水平基本无差别，排除血清这一干扰因素。与空白对照组比较，5%、10%和20%的芍药甘草含药血清组的p-Akt磷酸化水平显著降低（P＜0.01），而且呈现剂量依赖性。见图2、图3。

图2 p-Akt磷酸化表达水平

图3 芍药甘草含药血清对大鼠T淋巴细胞中p-Akt磷酸化表达水平的影响（±s，n=8）

3 讨论

哮喘的发病机制较为复杂，其免疫机制研究越来越深入。T淋巴细胞在哮喘的发病过程中起到了重要作用，它不仅可能参与哮喘慢性气道炎症反应、气道重塑和症状学，而且可能在过敏免疫反应的启动中起中心作用[3]。细胞凋亡（apoptosis）是一种机体为维护内环境稳定而进行的程序性死亡，肺内淋巴细胞、嗜酸性粒细胞、中性粒细胞及气管平滑肌细胞及上皮细胞等细胞的凋亡异常均参与了哮喘发病[4]。细胞周期分为分裂期（M期）和间期，其中间期包括DNA合成前期（G1期）、DNA合成期(S期)和DNA合成后期（G2期），机体细胞能否顺利完成各阶段交替和增殖过程受到严密的调控，细胞生长抑制后G2/M期比例会下降。磷酯酰肌醇3激酶(PI3K)是一种特异性激酶，PI3K/AKT信号通路参与哮喘的慢性气道炎症过程，抑制PI3K可有效减少哮喘气道炎症[5]。芍药甘草汤是“医圣”张仲景的经典方剂，主要治疗伤寒伤阴，筋脉失养所致腿脚挛急等症。本实验研究表明，5%、10%和20%含药血清组能显著抑制大鼠T淋巴细胞生长，促进T淋巴细胞凋亡，显著增加G0/G1期细胞比例，同时显著降低G2/M细胞比例（P＜0.01），提示芍药甘草汤能抑制T淋巴细胞生长，通过仰制细胞DNA的合成及有丝分裂,促使细胞由G2+M期转至G0/G1期，减少分裂，并促进T淋巴细胞凋亡。另一方面，本实验表明，与空白对照组比较，5%、10%和20%的芍药甘草含药血清组的p-Akt磷酸化水平显著降低（P＜0.01），而且呈现剂量依赖性。PI3K抑制剂LY294002亦能显著降低p-Akt磷酸化水平。提示芍药甘草汤防治哮喘的作用机制可能与抑制PI3K、降低T淋巴细胞p-Akt磷酸化水平，进而减少气道炎症有关，但其内在机制仍需进一步研究。