miR-508-5p介导mTOR对骨肉瘤细胞自噬的影响

彭丽娇　吴廷瑞　李骁　黄静

【摘要】 目的：探討miR-508-5p对骨肉瘤细胞自噬及雷帕霉素靶向基因（mTOR）信号通路的影响。方法：收集近五年收治的59例骨肉瘤患者的癌组织与癌旁正常组织，另购买人骨肉瘤细胞株MG-63与人成骨细胞hFOB，采用RT-PCR法检测各组织与细胞中miR-508-5p与mTOR mRNA的相对表达量;将MG-63细胞分成三组：空白组不进行转染，NC组转染空载质粒，过表达组转染miR-508-5p重组质粒，采用CCK-8法检测转染培养后的三组细胞增殖情况，流式细胞仪检测三组细胞凋亡率，采用RT-PCR法检测各组miR-508-5p与mTOR mRNA的相对表达量;采用Western blot法检测细胞中mTOR、Bax、Bcl-2、LC3-Ⅰ与LC3-Ⅱ蛋白的相对表达量。结果：相比癌旁正常组织与hFOB细胞，癌组织与MG-63细胞中miR-508-5p相对表达量均明显降低，而mTOR mRNA的相对表达量均明显升高，差异均有统计学意义（P<0.05）;相比空白组与NC组，过表达组miR-508-5p相对表达量明显上升，mTOR mRNA的相对表达量明显降低，细胞OD值明显降低，凋亡率明显增加，Bax与LC3-Ⅱ蛋白表达量均升高，而mTOR、Bcl-2与LC3-Ⅰ蛋白相对表达量均降低，差异均有统计学意义（P<0.05）。结论：miR-508-5p在骨肉瘤细胞中呈现低表达趋势，过表达miR-508-5p后可通过抑制mTOR通路，引发细胞自噬，从而抑制细胞增殖与促进细胞凋亡。

【关键词】 miR-508-5p 骨肉瘤 细胞自噬 雷帕霉素靶向基因 细胞系

[Abstract] Objective： To investigate the effect of miR-508-5p on autophagy and rapamycin targeting gene （mTOR） signaling pathway in osteosarcoma cells. Method： A total of 59 cases of osteosarcoma in our hospital in the past five years were collected from cancer tissues and adjacent tissues， and human osteosarcoma cell line MG-63 and human osteoblasts hFOB were purchased. miR-508-5p and mTOR were detected by RT-PCR MG-63 cells were divided into three groups： blank group was not transfected， NC group was transfected with empty plasmid， over expression group was transfected with miR-508-5p recombinant plasmid， CCK-8 method was used to detect the proliferation of three groups of cells after transfection， flow cytometry was used to detect the apoptosis rate of three groups， RT-PCR method was used to detect the relative expression of miR-508-5p and mTOR mRNA in each group; Western blot was used to detect the relative expression of mTOR， Bax， Bcl-2， LC3-Ⅰ and LC3-Ⅱ in the cells. Result： The relative expression of miR-508-5p in cancer tissue and MG-63 cell were significantly lower than those in normal tissue and hFOB cell， while the relative expression of mTOR mRNA were significantly higher， the differences were statistically significant （P<0.05）. Compared with the blank group and NC group， the relative expression of miR-508-5p， mTOR mRNA， odvalue， apoptosis rate， Bax and LC3-Ⅱ protein in the overexpression group increased significantly， while the relative expression of mTOR， Bcl-2 and LC3-Ⅰ protein decreased significantly， the differences were statistically significant （P<0.05）. Conclusion： The expression of miR-508-5p was low in osteosarcoma cells， and the over expression of miR-508-5p can induce autophagy by inhibiting mTOR pathway， thus inhibiting cell proliferation and promoting cell apoptosis.

[Key words] miR-508-5p Osteosarcoma Autophagy Mammalian target of rapamycin Cell line

First-authors address： The Affiliated Hospital of Guangdong Medical University， Zhanjiang 524000， China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2020.17.002

骨肉瘤也叫成骨肉瘤，是由于间充质干细胞向成骨细胞的遗传与表观遗传分化引起的一种恶性肿瘤，在儿童与青少年中较为常见。骨肉瘤生长迅速，有着较高的组织破坏性与迁移率，传统的手术切除预后并不理想，因此，寻找新的有效控制措施对改善患者的预后有着十分重要的意义[1-2]。近年来分子靶向治疗为临床及研究的热点，与肿瘤形成与进展的信号通路及相关的基因相继被发现，微小RNA（microRNA，miRNA）则是其中一类。相关研究表明，miR-508-5p在骨肉瘤中表达异常，且与骨肉瘤的分期有关，可能参与骨肉瘤的发生与进展，有望成为新的靶向治疗点[3]。雷帕霉素靶向基因（mammalian target of rapamycin，mTOR）是与肿瘤形成密切相关的一个重要的真核细胞信号，参与免疫抑制、转录与蛋白合成，具有调节细胞自噬、生长与凋亡等，在多种癌症中表达异常，其调控的信号机制目前研究得较多[4-6]。基于此，本文探讨了骨肉瘤中miR-508-5p表达及其可能的调控信号机制，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 收集近五年收治的59例骨肉瘤患者的癌组织与癌旁正常组织，所有患者均经影像学检查与术后病理确诊为骨肉瘤，患者组织收集前未进行过放化疗。59例患者中男38例，女21例，平均年龄（21.50±10.55）岁。

1.2 材料与试剂 人骨肉瘤细胞MG-63与人成骨细胞hFOB1.19均来源于中科院细胞库，MEM与DMEM/F12培养基购自美国Gibco公司，LipofectaminTM 2000转染试剂购自美国Invitrogen公司，Taqman miRNA检测试剂盒与实时荧光PCR仪购自美国ABI公司，兔抗人抗体与GAPDH兔抗人抗体、Annexin V-FITC/PI凋亡检测试剂盒均购自美国Sigma公司，HRP标记的山羊抗兔IgG购自美国KPL公司，RNA提取試剂盒、BCA蛋白定量检测试剂盒均购自上海索莱宝生物技术公司，ECL电化学发光显影液购自Invitrogen，CCK8试剂盒购自南京固与生物，引物序列由广州生工生物设计合成。

1.3 方法

1.3.1 细胞培养与分组 将hFOB细胞株培养于DMEM/F12培养液中，置于33.5 ℃、5%CO2孵育箱中培养，MG-63细胞培养于MEM培养液中，置于37 ℃、5%CO2孵育箱中培养，得到对数期生长MG-63细胞，随机分为三组进行相应的操作：空白组不进行转染，NC组转染空载质粒，过表达组转染miR-508-5p重组质粒，转染48 h。以下每组检测均设置3个平行复孔，每孔重复检测3次取平均值。

1.3.2 各组织与细胞中mRNA相对表达量的测

定 对所有患者癌组织与癌旁正常组织、未转染的对数期MG-63与hFOB细胞、转染后的三组细胞分别提取总RNA，进行逆转录后得到cDNA，采用RT-PCR法检测miR-508-5p与mTOR mRNA的相对表达量，以GAPDH作为内参，2-ΔΔCt法计算相对表达含量。

1.3.3 CCK-8法检测细胞增殖 将转染48 h后的三组细胞以胰酶消化，制成细胞悬液，取100 μL/孔接种于96孔板，加入CCK-8后在37 ℃培养箱内孵育2 h后，采用酶标仪测定450 nm处的OD值。

1.3.4 流式细胞仪检测细胞凋亡 将转染48 h的三组细胞以胰酶消化，收集于流式管内，6 ℃预冷孵育，以1*Annexin V结合液悬浮细胞，Annexin V-FITC着色，置于4 ℃冰箱避光静置后，加入PI混匀静置，使用流式细胞仪检测，计算三组凋亡率（%）=（早晚期凋亡细胞数之和/总细胞数）×100%。

1.3.5 Western blot检测蛋白相对表达量 提取转染后三组细胞的总蛋白，BCA法检测各组蛋白浓度，进行10%的聚丙烯酰胺凝胶电泳，电转、封闭，添加一抗后4 ℃孵育过夜，滴加HRP标记的山羊抗兔IgG后在室温孵育1 h，采用电化学发光显色，扫描条带灰度值，以GAPDH作为内参，计算各蛋白相对表达量。

1.4 统计学处理 采用SPSS 21.0进行数据的统计分析，计量资料用（x±s）表示，两组间数据采用独立样本t检验进行比较，多组间数据采用单因素方差分析，事后两两比较采用LSD-t检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 骨肉瘤组织及其细胞系中miR-508-5p与mTOR mRNA的相对表达量比较 与癌旁正常组织（1.22±0.47）比较，骨肉瘤组织中miR-508-5p相对表达量（0.41±0.15）明显降低（t=7.767，P<0.05）;与癌旁正常组织（1.03±0.31）比较，骨肉瘤组织中mTOR mRNA的相对表达量（1.62±0.59）明显升高（t=7.853，P<0.05）;与人成骨细胞hFOB（1.07±0.08）比较，骨肉瘤细胞系MG-63中miR-508-5p相对表达量（0.53±0.09）明显降低（t=7.767，P<0.05）;与人成骨细胞hFOB（0.98±0.09）比较，骨肉瘤细胞系MG-63中mTOR mRNA的相对表达量（1.59±0.10）明显升高（t=7.853，P<0.05）。见图1。

2.2 细胞转染后三组细胞miR-508-5p与mTOR mRNA的相对表达量比较 相比空白组（0.61±0.11）与NC组（0.65±0.10），过表达组miR-508-5p相对表达量（6.38±1.82）明显上升（F=29.757，P<0.05）;相比空白组（1.16±0.09）与NC组（1.08±0.11），过表达组mTOR mRNA的相对表达量（0.61±0.11）明显降低（F=26.315，P<0.05）。见图2。

2.3 转染后三组细胞增殖情况与凋亡率比较 相比空白组（0.58±0.03）与NC组（0.55±0.06），过表达组细胞48 h OD值（0.36±0.04）明显降低（F=21.000，P<0.05）;相比空白组（3.26±0.73）%与NC组（3.24±0.61）%，过表达组48 h细胞凋亡率（15.39±1.95）%明显增加（F=93.922，P<0.05）。见图3。

2.4 转染后三组细胞中mTOR、Bax、Bcl-2与LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ蛋白的相对表达量比较 相比空白组与NC组，过表达组细胞Bax与LC3-Ⅱ蛋白表达量升高，而mTOR、Bcl-2与LC3-Ⅰ蛋白相对表达量降低，差异均有统计学意义（P<0.05），

见表1。

3 讨论

miRNA是一种具有广泛基因调节功能的非编码RNA，具有多种生物学功能，可以通过与目标mRNA的非编码区域以碱基配对的方式结合，从而促使mRNA降解或翻译过程受阻滞，沉默相应的下游基因表达，进一步调节细胞内多种病理生理活动，包括细胞周期调控、细胞增殖、分化与凋亡等过程[7-9]。相关研究指出多种miRNA均参与了骨肉瘤的发生、进展，例如，miR-34a作为抑癌基因p53的直接靶向miRNA，过表达后可以抑制肿瘤细胞增殖;miR-570-3p表达上调可抑制肺癌转移相关蛋白与凋亡相关的翻译从而抑制骨肉瘤细胞的转移;miR-222可通过下调肿瘤启动因子从而抑制肿瘤细胞增殖与侵袭能力[10-12]。除此之外，不断有新的miRNA在临床研究中被陆续发现，这将为骨肉瘤的药物治疗提供新的靶点。

本研究通过对本院收治的109例骨肉瘤患者的癌组织与癌旁正常组织进行分子检测，发现miR-508-5p在癌组织中呈现低表达趋势，而mTOR则呈现高表达趋势，提示这两种分子均可能与骨肉瘤的发生发展相关。既往关江锋等[3]通过检测66例骨肉瘤组织和31例骨软骨瘤组織中miR-508-5p的表达量亦发现，骨肉瘤组织中miR-508-5p呈低表达，其表达量与分期及AKP水平有关，通过生存分析还发现miR-508-5p低表达与患者较短生存期相关，提示其对预后有一定价值[3]。mTOR是细胞自噬调控通路中关键负调节因子，可以通过影响下游自噬复合体的形成，进而抑制细胞自噬，在多种癌症中已被发现呈现高表达趋势[13-15]。同样在骨肉瘤细胞系MG-63细胞与成骨细胞hFOB中亦表现出癌组织与正常组织中的差异，亦可说明同样的道理。

为进一步验证miR-508-5p与骨肉瘤细胞自噬的关系，笔者构建了miR-508-5p重组质粒过表达载体转染细胞株，通过RT-PCR检测证明转染组miR-508-5p相对表达量明显上升，mTOR mRNA的相对表达量明显降低，表明过表达的细胞模型构建成功。相比空白组与NC组，过表达组细胞OD值明显降低，凋亡率明显增加，这进一步提示上调miR-508-5p的表达可抑制肿瘤细胞增殖与促进细胞凋亡，具体的机制可能与如下的分子检测结果相关。通过Western blot检测，发现Bax与LC3-Ⅱ蛋白表达量均升高，而mTOR、Bcl-2与LC3-Ⅰ蛋白相对表达量均降低。Bax与Bcl-2是一对拮抗的调控细胞凋亡因子，Bax升高而Bcl-2降低导致细胞凋亡率升高[16-17];而LC3-Ⅰ与LC3-Ⅱ则是与自噬相关的一对调控因子，LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值增加导致细胞自噬增多，这与mTOR比值降低时协同发生，导致骨肉瘤细胞自噬增加，从而使得细胞增殖率降低，凋亡率升高[18-19]。

综上所述，miR-508-5p在骨肉瘤细胞中呈现低表达趋势，过表达miR-508-5p后可通过抑制mTOR通路，引发细胞自噬，从而抑制细胞增殖与促进细胞凋亡。

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（收稿日期：2020-04-09） （本文编辑：张爽）